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SARS-CoV-2的近期起源(BY Google translate)

克里斯蒂安·安德森（Kristian G.Andersen）1,2 *，安德魯·朗巴特（Andrew Rambaut）3，伊恩·利普金（W.Ian Lipkin）4，愛德華·霍姆斯（Edward C.Holmes）5和羅伯特·F·加里（Robert F.Garry）6,7

1美國斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）免疫學和微生物學系，美國加利福尼亞州92037。

2Scripps Research Translational Institute，拉荷亞，CA 92037，美國。

3英國愛丁堡愛丁堡大學進化生物學研究所。

4美國紐約哥倫比亞大學梅爾曼公共衛生學院感染與免疫中心。

5澳大利亞悉尼大學生命與環境科學學院和醫學學院瑪麗·巴希爾傳染病與生物安全研究所。

6杜蘭大學醫學院，美國路易斯安那州新奧爾良微生物學和免疫學系。

7 Zalgen Labs，LCC，美國馬里蘭州日耳曼敦。

*通訊作者：

克里斯蒂安·安德森（Kristian G.Andersen）,免疫學和微生物學系, 斯克里普斯研究所，拉荷亞，CA 92037，美國。

自中國湖北省武漢市首次報道新型肺炎（COVID-19）以來，關於致病性病毒SARS-CoV-2的起源一直存在大量討論和不確定性。現在，SARS-CoV-2感染在中國非常普遍，每個省都有病例。截至2020年2月14日，已經確診了64,473起此類病例，其中1,384人死於該病毒。由於報告的輕度和無症狀病例有限，這些官方病例數可能被低估了，並且該病毒顯然能夠有效地進行人與人之間的傳播。基於可能傳播到醫療體系較弱的國家，世界衛生組織宣布COVID-19疫情為國際關注的突發公共衛生事件（PHEIC）。目前尚無針對該疾病的疫苗或特異性療法。

SARS-CoV-2是已知感染人類的??冠狀病毒科的第七名成員。其中三種病毒，SARS CoV-1，MERS和SARS-CoV-2，可以引起嚴重的疾病。四，HKU1，NL63，OC43和229E與輕度呼吸道症狀有關。本文中，我們回顧了從可用基??因組序列數據的比較分析中可以推斷出SARS-CoV-2的起源和早期進化的方法。特別是，我們提供了有關SARS-CoV-2基因組中顯着特徵的觀點，並討論了可能出現這些特徵的場景。重要的是，該分析提供了證據，表明SARS-CoV-2不是實驗室構建物也不是有意操縱的病毒。

下文描述的α-和β-冠狀病毒（Coronaviridae家族）的基因組比較確定了SARS-CoV-2基因組的兩個顯着特徵：（i）基於結構模型和早期生化實驗，SARS-CoV-2似乎針對與人ACE2受體結合; （ii）SARS-CoV-2的高度可變的穗狀蛋白（S）通過插入十二個核苷酸在S1和S2邊界具有一個多鹼基（弗林蛋白酶）切割位點。另外，該事件導致在多鹼基切割位點附近獲得了三個預測的O-連接的聚糖。

SARS-CoV-2受體結合結構域的突變
SARS-CoV和SARS相關冠狀病毒的刺突蛋白中的受體結合域（RBD）是病毒基因組中變化最大的部分。 RBD中的六個殘基似乎對於與人ACE2受體結合併確定宿主範圍至關重要。使用基於SARS-CoV的Urbani應變的坐標，它們是Y442，L472，N479，D480，T487和Y4911。 SARS-CoV-2中的相應殘基為L455，F486，Q493，S494，N501和Y505。與它最密切相關的病毒Ra Rh13相比，SARS-CoV-2中的這六個殘基中有五個是突變的，它是從Rhinolophus affinis bat採樣而來的，與?96％相同（圖1a）。根據建模1和生化實驗3,4，SARS-CoV-2似乎具有一種RBD，它可能與人，非人靈長類，雪貂，豬和貓以及其他具有高受體的物種對ACE2的親和力很高。同源性1。相比之下，SARS-CoV-2在與SARS樣病毒相關的其他物種（包括齧齒動物和蜂巢）中與ACE2的結合效率可能較低。

SARS-CoV-2 S蛋白中第486位殘基的苯丙氨酸（F）對應於SARS-CoV Urbani菌株中的L472。值得注意的是，在SARS-CoV細胞培養實驗中，L472突變為苯丙氨酸（L472F）5，據預測，苯丙氨酸對於SARS-CoV RBD與人ACE2受體6的結合是最佳的。然而，蝙蝠的幾個SARS樣冠狀病毒中也存在此位置的苯丙氨酸（圖1a）。儘管這些分析表明SARS-CoV-2可能能夠以高親和力結合人ACE2受體，但相互作用並不被認為是最佳的。此外，SARS-CoV-2的RBD中的幾個關鍵殘基與先前描述的最適合人ACE2受體結合的殘基不同6。與這些計算預測相反，最近的結合研究表明，SARS-CoV-2

多元切割位點和O-連接聚糖
SARS-CoV-2的第二個顯着特徵是在刺蛋白的兩個亞基S1和S2（圖1b）8,9的連接處的刺蛋白中有一個預測的多元切割位點（RRAR）。除了兩個鹼性精氨酸和一個在切割位點的丙氨酸外，還插入了一個脯氨酸。因此，完全插入的序列是PRRA（圖1b）。脯氨酸插入產生的強烈轉角預計會導致在多鹼基切割位點側翼的S673，T678和S686中添加O-連接的聚糖。以前在相關譜系Bβ冠狀病毒中未發現多鹼基切割位點，這是SARS-CoV-2的獨特特徵。一些人β冠狀病毒，包括HCoV-HKU1（譜系A），具有多鹼基切割位點，以及在S1 / S2切割位點附近具有預測的O-連接聚糖。

儘管尚不清楚SARS-CoV-2中多鹼基切割位點的功能後果，但SARS-CoV的實驗表明，在S1 / S2交界處改造這樣的位點可增強細胞-細胞融合，但不會影響病毒的進入10。多元裂解位點允許弗林蛋白酶和其他蛋白酶有效裂解，並且可以在選擇快速複製和傳播病毒的條件下（例如高密度雞群）在禽流感病毒血凝素（HA）蛋白的兩個亞基的連接處獲得）。 HA在細胞-細胞融合和病毒進入中的功能與冠狀病毒S蛋白相似。通過插入或重組獲得HA中的多元切割位點，可將低致病性禽流感病毒轉化為高致病性形式11-13。在細胞培養物中或動物反覆傳代後，還觀察到流感病毒HA獲得了多價切割位點14,15。同樣，無毒的新城疫病毒分離株在雞的連續傳代過程中通過在融合蛋白亞基的交界處逐漸獲得一個多價裂解位點而成為高致病性16。三種預測的O-連接聚糖的潛在功能尚不清楚，但是它們可以產生一個“粘蛋白樣結構域”，該結構域可以屏蔽SARS-CoV-2穗蛋白上的潛在表位或關鍵殘基。需要進行生化分析或結構研究，以確定是否利用了預測的O-連接的聚糖位點。

圖1.（a）SARS-CoV-2刺突蛋白接觸殘基的突變。將SARS-CoV-2的突突蛋白（上圖）與最密切相關的SARS樣CoV和SARS-CoV-1進行比對。與ACE2受體接觸的刺突蛋白中的關鍵殘基在SARS-CoV-2和SARS-CoV Urbani菌株中均標有藍色框。 （b）獲得多元裂解位點和O-連接的聚糖。多元裂解位點標記為灰色，三個相鄰的預測的O-連接的聚糖標記為藍色。多元裂解位點和O-連接的聚糖都是SARS-CoV-2特有的，以前在譜系B beta冠狀病毒中沒有見過。顯示的序列來自NCBI GenBank，登錄號為MN908947，MN996532，AY278741，KY417146，MK211376。穿山甲冠狀病毒序列是從SRR10168377和SRR10168378（NCBI BioProject PRJNA573298）18,19產生的共有序列。

SARS-CoV-2起源的理論
SARS-CoV-2不可能通過實驗室處理現有的SARS相關冠狀病毒而出現。如上所述，SARS-CoV-2的RBD針對人ACE2受體的結合進行了優化，結合的有效結合溶液不同於已經預測的結合溶液。此外，如果已經進行了遺傳操作，則可以預期將使用可用於β冠狀病毒的幾種反向遺傳系統之一。但是，事實並非如此，因為遺傳數據表明SARS-CoV-2並非源自任何先前使用的病毒主鏈17。相反，我們提出了兩種可以合理解釋SARS-CoV-2起源的方案：（i）人畜共患病轉移之前在非人類動物宿主中的自然選擇，以及（ii）人畜共患病轉移之後在人類中的自然選擇。我們還討論了在傳代過程中進行選擇是否會引起相同的觀察特徵。

在動物宿主中進行選擇
由於許多早期的COVID-19病例與武漢的華南海鮮和野生動植物市場有關，因此該地點可能存在動物來源。鑑於SARS-CoV-2與蝙蝠類似SARS的CoV（尤其是RaTG13）的相似性，蝙蝠充當SARS-CoV-2的宿主是有道理的。但是，重要的是要注意，先前在人類中爆發的冠狀病毒包括直接接觸蝙蝠以外的動物，包括帶有遺傳上與SARS-CoV-1或分別為MERS-CoV。以此類推，與SARS-Cov-2密切相關的病毒可能正在傳播

對人類的隱秘適應 
SARS-CoV-2的祖先也有可能從非人類動物躍遷到人類，具有上述基因組特徵是通過在隨後的人與人之間的傳播過程中進行適應而獲得的。我們推測，一旦（同時或連續）獲得了這些適應措施，它將使疫情得以爆發，從而產生足夠大且異常的肺炎病例群，從而觸發最終發現它的監視系統。

到目前為止，所有測序的SARS-CoV-2基因組都具有很好的適應性RBD和多鹼基切割位點，因此是從具有這些特徵的共同祖先獲得的。穿山甲中存在一種與SARS-CoV-2中非常相似的RBD，這意味着即使我們還沒有確切的非人類祖細胞病毒，它也可能已經存在於跳躍到人類的病毒中。 。這使得多價切割位點插入發生在人與人之間的傳播過程中。以甲型流感病毒HA基因為例，需要特定的插入或重組事件才能使SARS-CoV-2成為流行病原體。

使用當前可用的基因組序列數據估算SARS-CoV-2的最新共同祖先（tMRCA）的時間，表明病毒在2019年11月下旬至12月上旬出現，20,21與最早的回顧性確診病例一致。因此，這種情況假定在最初的人畜共患病轉移事件與多鹼基切割位點的獲取之間存在一段無法識別的人類傳播時期。如果以前有許多人畜共患病事件在很長一段時間內產生人與人之間傳播的短鏈（所謂的“口吃鏈”），則可能會有足夠的機會。這基本上是阿拉伯半島MERS-CoV的情況，其中所有人類病例都是病毒從單峰駱駝反覆跳出的結果，產生了單個感染或傳播的短鏈最終得以解決。迄今為止，在過去8年中發生了2499例病例之後，還沒有出現人類適應症，這使MERS-CoV不能在人群中紮根。

我們如何測試SARS-CoV-2的秘密傳播是否能使人類適應？儲存血清樣品的基因組學研究可能會提供重要信息，但鑑於病毒血症的時間相對較短，因此可能無法在歷史樣品中檢測到低水平的SARS-CoV-2循環。回顧性血清學研究可能會提供參考，並且已經進行了一些此類研究。有人發現動物進口貿易商對冠狀病毒的血清陽性率為13％，而另一人指出，中國南方一個村莊的居民中有3％對這些病毒呈血清陽性24。有趣的是，武漢的200名居民沒有顯示冠狀病毒的血清反應活性。然而，至關重要的是，這些研究無法區分陽性血清反應是由於先前感染SARS-CoV-1還是-2。應該進行進一步的回顧性血清學研究，以確定先前人類在不同地理區域接觸過β-冠狀病毒的程度，尤其是使用可以區分多種β-冠狀病毒的測定方法。

通過時的選擇 
BSL-2多年來在世界各地的多個實驗室中進行了有關蝙蝠SARS樣冠狀病毒在細胞培養和/或動物模型中傳代的基礎研究25。還記錄了在BSL-2密閉環境下工作的實驗室人員在實驗室獲得SARS-CoV-1的實例29,30。因此，我們必須考慮有意或無意釋放SARS-CoV-2的可能性。從理論上講，SARS-CoV-2有可能在適應細胞培養傳代過程中獲得觀察到的RBD突變位點，正如在SARS-CoV5和MERS-CoV31研究中所觀察到的那樣。然而，如果有功能，則獲得多元裂解位點或O-連接的聚糖的說法反對這種情況。僅在細胞培養物或動物中長時間傳播低致病性禽流感病毒後，才觀察到新的多元切割位點。此外，通過細胞培養或動物傳代產生SARS-CoV-2將需要事先分離具有非常高遺傳相似性的祖病毒。然後，要在細胞培養物或具有類似於人的ACE-2受體的動物（例如雪貂）中進行大量傳代程序，就需要隨後的多鹼基切割位點的產生。還懷疑在細胞培養傳代中是否會發生O-連接聚糖的產生，因為這種突變通常表明免疫系統的參與，這在體外是不存在的。

結論
在全球COVID-19公共衛生緊急情況中，有理由懷疑流行病的起因是什麼。對動物病毒如何越過物種邊界來如此有效地感染人類的??詳細了解將有助於預防未來的人畜共患病事件。例如，如果SARS-CoV-2已預先適應另一種動物，那麼即使目前的流行病得到控制，我們也有未來再發生事件的風險。相反，如果我們描述的適應性過程發生在人類中，那麼即使我們重複了人畜共患病的轉移，除非發生相同系列的突變，它們也不太可能起飛。此外，鑑定出SARS-CoV-2的最親近的動物親屬將大大有助於病毒功能的研究。確實，RaTG13 bat序列的可用性促進了此處進行的比較基因組分析，有助於揭示RBD中的關鍵突變以及多鹼基切割位點的插入。

此處描述的基因組特徵可以部分解釋SARS-CoV-2在人類中的傳染性和傳播性。儘管基因組證據不支持SARS-CoV-2是實驗室構建體的觀點，但目前尚無法證明或否認本文所述的其起源的其他理論，並且尚不清楚未來的數據是否會幫助解決此問題。確定直接的非人類動物來源並從中獲得病毒序列將是揭示病毒起源的最確定的方法。此外，獲得有關該病毒的更多遺傳和功能數據將是有幫助的，包括受體結合以及多鹼基切割位點和預測的O-連接聚糖作用的實驗研究。同樣，對SARS-CoV-2潛在中間宿主的鑑定以及包括與武漢市場無關的早期病例的測序也將具有很高的信息意義。不管SARS-CoV-2的起源如何，對人類和其他動物進行肺炎的持續監測顯然至關重要。

致謝
我們感謝所有為SAISA-CoV-2基因組序列貢獻到GISAID數據庫（https://www.gisaid.org/ 25）和為Virological.org 16（http://virological.org/ 4）。我們感謝惠康基金會的支持。 ECH由ARC澳大利亞獲獎者獎學金（FL170100022）支持。 NIGA授予1U19AI135995-01支持KGA。 AR得到了Wellcome Trust（協作者獎206298 / Z / 17 / Z – ARTIC網絡）和歐洲研究理事會（授權協議號725422 – ReservoirDOCS）的支持。