接續：新冠病毒溯源九問（中）

眾多證據、線索指向同一個結論：Ralph S. Baric（拉爾夫·巴里克）就是新冠病毒的核心設計者；同時，也有跡象、線索顯示，新冠病毒並非出自單一團隊之手，新冠病毒有部分結構、功能，是巴里克團隊外的其它聯合設計者設計、引入的。

（一）拉爾夫·巴里克與新冠的逆轉錄

新冠病毒的逆轉錄特性

新冠病毒具有如下逆轉錄特性：它的RNA能逆轉錄為cDNA，並整合到人體被感染細胞的DNA中。

cDNA，即Complementary DNA，是RNA的互補DNA，有時也叫做RNA的DNA拷貝，或RNA的對應DNA。

什麼是逆轉錄呢？以DNA為模板轉錄出對應RNA的過程，叫（正）轉錄（transcription）；相反，以RNA為模板轉錄出對應DNA的過程，就叫做逆轉錄（reverse transcription）或反轉錄。

更通俗地說，照着DNA製作RNA，是轉錄，反之，照着RNA製作DNA，就是逆轉錄。

新冠病毒的逆轉錄特性有兩個論文依據。

論文依據一

2021年5月25日，麻省理工學院（MIT）、懷特黑德生物醫學研究所、國家癌症研究所等機構的一組科學家，包括幹細胞生物學家Rudolf Jaenisch教授、基因調控專家Richard Young教授，以及Liguo Zhang等人，在PNAS（美國國家科學院院刊）上發表了如下論文：
Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues
（逆轉錄的新冠病毒RNA 能整合到培養的人類細胞的基因組中，並能在患者組織中檢測到）
https://www.pnas.org/content/118/21/e2105968118

論文指出：
1、新冠病毒能夠利用人體內源性逆轉錄轉座子LINE-1 （long interspersed nuclear elements-1，長散布核元件-1)，將其RNA片斷逆轉錄為cDNA片斷並整合到被感染細胞的DNA中；

論文展示了研究中檢測到的，嵌有新冠cDNA序列的人體DNA嵌合序列，如下圖：

該嵌合序列是使用 Nanopore（納米孔） 測序測得的。圖中，
藍色部分是人類原有的基因組序列；
洋紅色部分是嵌入人類基因組的新冠全長NC亞基因組序列（序列中有省略號）；
黃色部分是LINE-1逆轉錄轉座子的特徵序列，其中，黃色+下劃線部分是LINE-1核酸內切酶的識別序列。

NC：nucleocapsid，核衣殼； NC 亞基因組是編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein）的RNA子序列。

2、新冠病毒還可使用LINE-1之外的其它內源性逆轉錄機制，如使用內源性IAP（intracisternal A-type particle，顱內A-型粒子）逆轉錄元件實現其RNA在人體內的逆轉錄與整合；

3、在急性感染細胞中，在重症患者的支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 中，都檢測到了嵌有新冠cDNA的人類DNA。雖然在急性感染細胞中檢測到的新冠cDNA比例極低，不超過組織樣本中新冠RNA總量的千分之一（這或許可以理解為，逆轉錄過程是比較滯後的），但在新冠重症患者的支氣管肺泡灌洗液中，以及在新冠死亡患者的屍檢樣本中，檢測到的新冠cDNA的比例可高達40%~50%。

4、檢測到的，逆轉錄產生的、嵌入到人體DNA中的cDNA序列主要對應新冠RNA 3' 端的亞基因組序列（包括編碼核衣殼蛋白NC亞基因組序列），
這些整合到人體DNA中的新冠基因組片斷不能在人體中組裝出有生物活性（傳染能力、複製能力）的新冠病毒。

5、嵌入人體DNA的新冠cDNA片斷在人體內轉錄出的RNA片斷，會使新冠PCR檢測呈陽性，這應該是如下現象的內在原因：許多新冠患者在康複數周乃至數月後，其PCR檢測仍持續、反覆呈陽性，顯示其體內有新冠RNA，但在其體內卻檢測不出新冠病毒。


論文依據二

2021年2月25日（發表時間早於論文一），華中科技大學（同濟醫學院）的Ximiao HE教授、Li-quan Zhou教授等四位中國科學家在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology（《細胞與感染微生物學前沿》）期刊上發表了一篇論文：
Exogenous Coronavirus Interacts With Endogenous Retrotransposon in Human Cells
（外源性冠狀病毒與人類細胞內源性逆轉錄轉座子的相互作用）
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2021.609160/full
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7959850/

這篇論文探討了多個課題。論文的如下部分深入研究了新冠病毒的逆轉錄特性：
SARS-CoV-2 RNA May Form Chimeric Transcripts With Retrotransposon RNA Especially LINE for Potential Insertion Into Host Genome
（新冠病毒RNA 可以與某些反轉錄轉座子，特別是LINE轉座子形成嵌合轉錄本，導致對宿主基因組的潛在插入）

論文指出：
1、冠狀病毒不應自行整合到宿主基因組中；

2、新冠病毒的RNA能夠嵌合到人類基因組中；

下圖展示了研究者檢測到的，嵌入人體DNA中，分別與人體基因組三種特徵序列（3'-UTR、LINE、SINE）相連接的新冠序列片斷（圖中藍色部分）。

3'-UTR：three prime UnTranslated region，3'非轉譯區，是信使核糖核酸（mRNA）中，緊接在編碼區之後的一段控制序列，該段序列不被翻譯為蛋白。

LINE的全稱見論文一，SINE的全稱稍後給出。

3、新冠基因與人類TE基因嵌合的效率遠高於它與人類非TE基因嵌合的效率（這應該可以理解為，新冠RNA與人類基因組的嵌合通常都有TE元件參與或介入）；
TE：transposable element，轉座子或跳躍子，一類能夠通過轉錄或逆轉錄，複製、剪切、粘貼到基因組其它位置的DNA序列片斷。

4、LINE、SINE 和LTR 等類型的人類內源性轉座子（TE）元件都能參與、介入新冠基因組與人體基因組的嵌合；對促成這種嵌合表現最高效的TE元件是LINE 家族，在LINE家族中，表現最高效的是LINE-1 逆轉錄轉座子；

SINE：Short interspersed nuclear elements，短散布核元件，和LINE一樣，也是一類non-LTR反轉錄轉座子。這類反轉錄轉座子沒有長末端重複序列(non-long terminal repeats，non-LTR)，自身也沒有轉座酶或整合酶的編碼能力，需要在細胞內既有的酶系統作用下進行轉座。

LTR：long terminal repeats，是一類具有長末端重複序列的反轉錄轉座子，包括Tyl-copia類和Ty3-gypsy類轉座子。這類反轉錄轉座子可以自行編碼反轉錄酶(Reverse transcriptases)或整合酶(integrases)，自主地進行轉錄。LTR的轉座機制與逆轉錄病毒相似，區別是，不能像逆轉錄病毒（如艾滋病病毒）那樣以自由感染的方式進行傳播。高等植物中的反轉錄轉座子主要屬於Tyl-copia類，分布十分廣泛，幾乎覆蓋了所有高等植物種類。

5、在人類被感染細胞DNA中可以檢測到新冠RNA不同位置的亞基因組（RNA子序列或序列片斷）。在檢測到的嵌入人體DNA的新冠基因片斷中，新冠RNA後部的基因片斷所占比例顯著高於其它位置的基因片斷（論文一提到的3' 端的NC亞基因組序列就位於新冠RNA的後部）；

下圖是對新冠感染的Calu-3 細胞（人類肺腺癌細胞系）進行相關檢測的結果圖。

橫坐標：新冠基因序列；
縱坐標：基因序列各個位置處新冠基因片斷的檢測數。

由上而下，
第一層：樣本中不同位置處新冠基因片斷的檢測數，
第二層：新冠-人類嵌合基因中，不同位置處新冠基因片斷的檢測數，
第三層：TE相關的新冠-人類嵌合基因中，不同位置處新冠基因片斷的檢測數，
第四層：LINE相關的新冠-人類嵌合基因中，不同位置處新冠基因片斷的檢測數。

由圖可見，新冠RNA後部的基因片斷嵌入人體DNA的頻率最高。

6、在NCBI 生物數據庫（GenBank）人類基因組數據中檢索不到匹配長度>=200bp的新冠病毒基因片斷（即，人類基因組中不存在與新冠基因組一致，且長度>=200個鹼基對的基因片斷）。這表明，在人體DNA中檢測到的新冠RNA片斷是外來的，來自新冠病毒；而且，它們不應該是通過序列同源性識別進入人類細胞核並嵌入人類基因組（DNA）的，它們是逆轉錄並整合進入人類基因組的。

新冠的逆轉錄特性是人為設計的

將自身RNA逆轉錄為cDNA並整合到宿主基因組中，這原本是逆轉錄科病毒（如艾滋病病毒）的獨特功能。由上述兩篇論文可知，新冠病毒也具有類似的特性。但相比艾滋病病毒，新冠病毒的這一功能還不完善：嵌入到人體DNA中的艾滋病基因組能組裝出具有感染、複製能力的艾滋病病毒，而嵌入到人體DNA中的新冠基因組不能組裝出具有感染、複製能力的新冠病毒。

閱讀、研究論文一、論文二之後，我又通讀了這兩篇論文引用的，與“非逆轉錄病毒基因組嵌入宿主基因組”有關的幾篇論文，基於這些論文，可作出如下判斷：

1、以往雖然數次報告過非逆轉錄病毒基因組嵌入宿主基因組的情況，但是，所涉及的病毒無一是冠狀病毒，也就是說，在新冠出現前，從未報告過冠狀病毒基因組嵌入宿主基因組的情況。

因此，從既有信息看，新冠病毒RNA可逆轉錄並整合入宿主基因組這一特性，在冠狀病毒中是獨一無二的，這是新冠病毒的又一個獨一無二特性。

2、非逆轉錄病毒基因組片斷嵌入宿主基因組的情況在自然界中發生的頻率非常低（累積存在若干實例與發生頻率非常低並不矛盾）；然而，由論文一可知，在支氣管肺泡灌洗液等人體樣本中，新冠RNA發生逆轉錄、嵌合的機率可高達40%~50%，這對非逆轉錄病毒來說，是極為罕見、極不尋常的。

3、之前報告的嵌入宿主基因組的非逆轉錄病毒基因多為較短的基因片斷，而新冠病毒則能將其整個NC亞基因組（核衣殼蛋白子序列，含1662個鹼基對）完整嵌入人類DNA。在我印象中，除細小病毒科病毒外，其它非逆轉錄病毒應該沒有報告過如此規模的嵌入。

可進一步作出如下判斷：
1、新冠病毒應該具備一組相應結構，這組結構能與人體中的內源性逆轉錄轉座子或逆轉錄酶協調、配合工作，使新冠RNA得以逆轉錄為cDNA並整合到人體細胞DNA中。

2、上述結構應該是新冠病毒獨有的，因為其它冠狀病毒都不具備新冠的逆轉錄、整合特性。

3、新冠病毒RNA逆轉錄為cDNA並嵌入人體DNA這一特性，不是冠狀病毒自然演化產生的，因為除新冠外，沒有任何一種冠狀病毒表現出這一特性（從未有一種病毒象新冠病毒那樣，能“自然演化”出不下五種獨一無二的特性）。

4、新冠病毒的逆轉錄、整合特性，是人為設計出來的。有人賦予了新冠病毒利用人體的逆轉錄轉座子、逆轉錄酶，逆轉錄自身RNA為cDNA，並將其整合到人體DNA中去的能力。如果他將這一逆轉錄功能設計得更完善的話，那麼，新冠病毒將和艾滋病病毒一樣，一旦感染，病毒基因就會固化在人體DNA中，一旦感染，人體DNA中的病毒基因就會源源不斷地組裝出新病毒，一旦感染，就無法徹底清除病毒及其基因、無法治癒。

誰設計了新冠的逆轉錄特性？

最大的設計嫌疑人仍然是拉爾夫·巴里克（Ralph S. Baric）。

為什麼這麼說？因為Ralph S. Baric是這個世界上最了解逆轉錄的人，是最頻繁使用逆轉錄技術的人，是與新冠的逆轉錄特性淵源最深的人。

Ralph S. Baric2000年有一項重大發明：合成冠狀病毒的反向遺傳平台。

2000年11月，Ralph S. Baric領導的一個科學團隊發表了一篇Journal of Virology論文：
Strategy for Systematic Assembly of Large RNA and DNA Genomes: Transmissible Gastroenteritis Virus Model
（大RNA和DNA基因組系統組裝策略：傳染性胃腸炎病毒模型）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC110934/

在這篇論文中，Ralph S. Baric等人使用反向遺傳技術合成了豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV，Transmissible gastroenteritis virus，一種α譜系冠狀病毒），並在培養細胞中收穫了TGEV的活性毒株。
 
這是人類首次人工合成冠狀病毒。冠狀病毒是結構最複雜的一類病毒，其基因組在單鏈正極性RNA基因組中是最大、最長的，人工合成冠狀病毒是一個非同尋常的科學創舉。

論文明確指出：使用構建TGEV的反向遺傳技術可以對冠狀病毒基因組進行精確的基因改造。這其實意味着，可以使用反向遺傳平台對冠狀病毒進行無痕跡的設計、改造；而且，反向遺傳平台使冠狀病毒的設計、改造很大程度上簡化為基因序列的設計、編輯。

Baric發明的反向遺傳平台與新冠病毒的逆轉錄特性有什麼關聯呢？

論文一指出了新冠病毒的如下逆轉錄特性：
新冠病毒能利用人體內源性逆轉錄轉座子將其RNA片斷逆轉錄為cDNA片斷，並整合到被感染細胞的DNA中。

反向遺傳平台又有什麼特點呢？

反向遺傳平台的基本功能是，基於冠狀病毒的基因序列（RNA序列）合成冠狀病毒。用於合成冠狀病毒的基因序列，可以是已知冠狀病毒的基因序列，也可以是人為設計、人為改造過的基因序列。

反向遺傳平台使用的最基本技術是逆轉錄技術，使用反向遺傳平台合成冠狀病毒時，必須經過以下步驟：
將冠狀病毒的RNA序列分斷，逆轉錄出各個RNA序列片斷對應的cDNA片斷，再將cDNA片斷整合在一起，組裝出冠狀病毒的全長cDNA。
註：上述幾個步驟，用一句話概括，就是基於病毒的基因序列（符號）組裝病毒的遺傳物質cDNA。

對照上面兩段紅色加黑內容，不難看出，新冠的逆轉錄、整合特性，與反向遺傳平台逆轉錄、組裝全長cDNA的過程，二者的工作內容、工作步驟極為相似。

反向遺傳平台問世後，Ralph S. Baric幾乎每篇論文都要使用該平台，使用逆轉錄技術合成冠狀病毒，他研究、實驗所用的冠狀病毒，幾乎都是使用反向遺傳平台自行合成的。Ralph S. Baric和逆轉錄打了近20年交道，對逆轉錄爛熟於胸，與逆轉錄親密無間！

看幾個Ralph S. Baric的論文標題。

2002年11月，Ralph S. Baric等人合成小鼠肝炎病毒（一種β譜系冠狀病毒）A59株系的Journal of Virology論文：
Systematic Assembly of a Full-Length Infectious cDNA of Mouse Hepatitis Virus Strain A59
（小鼠肝炎病毒A59毒株全長傳染性cDNA的系統組裝）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC136593/

2003年10月28日，Ralph S. Baric團隊、美國陸軍傳染病醫學研究院（迪特里克堡實驗室所屬單位）、范德堡大學醫療中心合成SARS病毒的PNAS論文：
Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus
（SARS病毒全長傳染性cDNA的反向遺傳學）
https://www.pnas.org/content/100/22/12995

2013年10月1日，Ralph S. Baric團隊合成MERS病毒（中東呼吸綜合症冠狀病毒）的PNAS論文：
Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus
（MERS病毒全長傳染性cDNA的反向遺傳學）
https://www.pnas.org/content/110/40/16157

以合成MERS病毒的這篇論文為範例，我們直觀、近距離的地“觸摸”一下反向遺傳平台的工作過程吧：
a. 將MERS-CoV的RNA序列分為7個片斷，逆轉錄出每個RNA序列片斷對應的cDNA片段，並在這些cDNA片斷中插入識別標記；
b. 通過內切酶，將逆轉錄得到7個cDNA片段無縫組裝為MERS病毒的全長cDNA；
c. 將全長cDNA轉錄為MERS的RNA（這次得到的是RNA遺傳物質實體，不是序列符號）；
d. 通過電穿孔將MERS的RNA釋放到Vero細胞（非洲綠猴腎細胞系細胞）中；
e. 電穿孔後48-72小時內，在Vero細胞培養物中檢測到了細胞病變效應，檢測到了相當滴度（濃度）的帶有識別標記（步驟a所加）的MERS病毒RNA及MERS-CoV毒株（rMERS-CoV）。這說明人工合成的MERS病毒RNA能夠在Vero細胞內自我複製並組裝出完整的MERS病毒毒株；
f. 將步驟e得到的MERS病毒毒株rMERS-CoV放入未被病毒感染過的Vero 81細胞培養物中，12小時後，可觀察到細胞感染特徵，這說明人工合成的MERS病毒RNA組裝出的MERS病毒rMERS-CoV具有細胞感染能力及傳染性；
g. 實驗證明，rMERS-CoV還可感染並在純化的原代肺泡II肺細胞、微血管內皮細胞、成纖維細胞等多種人體細胞中有效複製。

很可能，因為技癢，Ralph S. Baric抑制不住賦予新冠病毒逆轉錄能力的強烈衝動；但之後因為某些原因（後怕或良心不安），在實施了部分設計後，中途又將之擱置。因而，新冠病毒的逆轉錄功能是一個不完善的作品，其嵌入人體DNA中的基因組不能象艾滋病基因組那樣，組裝出有活性的病毒。否則，新冠將成為另一種不治之症。

（未完待續）

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