（本文作於2020年6月6日，原文地址：實驗室合成、編輯SARS-CoV-2簡明教程）


本文要點

1. sars-cov-2是實驗室生成的；

2. 實驗室製造sars-cov-2的主要手段是基因編輯（基因合成也是一種基因編輯）；

3. 首先通過基因合成，得到一個中間病毒--一個嵌合的冠狀病毒。這個嵌合病毒的基因序列，相當於是將SARS-CoV的一小段特別的基因序列，“粘貼”到CoVZC45基因序列的對應位置而得到的。

4. sars-cov-2不是單純的嵌合病毒。對上述嵌合病毒，還需要再做多處基因編輯，這些編輯將利用已有的生物遺傳學知識對病毒進行各種針對性優化，使新病毒集自然界多種病毒（包括非冠狀病毒）的優異特性於一身，比已有的任何冠狀病毒都更強大、更全面，更難以免疫識別，更難以抵禦，更難以醫治；

5. 功能性的基因編輯完成後，還需對病毒基因序列大體均勻地嘗試不破壞既有功能的附加基因修改，儘可能模糊之前所做的人工合成與人工編輯痕跡，使人造病毒看上去象是自然變異產生的。

關於CRISPR/Cas9

2012年，CRISPR/Cas9橫空問世，基因編輯技術得以突飛猛進，進入新的時代（第三代）。CRISPR/Cas9號稱“基因神剪”，它使之前艱深高難的基因編輯工作一下子變得設計簡單，操作便捷、高效可靠起來，其使用門檻、操作難度和成本也都大大降低，到2013年，它被迅速應用到生物、醫學、農業、環境等多個領域，造就了一批批科研奇蹟，這其中就包括2013年對冠狀病毒感染機制的重大發現。CRISPR/Cas9這一利器使基因編輯不再是一種高難技術，如果不考慮法律、安全和倫理、道德等因素，藉助CRISPR/Cas9，無論是編輯人類胚胎DNA，還是編輯冠狀病毒RNA，都不是一件很困難的事。

實驗室合成、編輯sars-cov-2簡明教程

0. 注意事項

請在符合安全等級的實驗室進行本實驗，並嚴格遵守實驗室安全防護規程。

1. 實驗目標
我們的目標是製作一個β譜系的冠狀病毒，這個病毒後來被稱為SARS-CoV-2或新冠或2019-nCoV；

2. 選定基因改造的底版病毒

目標病毒的基因序列將包含近3萬個鹼基對。作為新病毒的始創者，我們不能像後來的瑞士人那樣，從零開始拼裝這個新病毒，我們挑選了一個已存在的β譜系冠狀病毒CoVZC45作為改造底版，這樣可使基因改造工作量最小化。

CoVZC45，這一作為改造底版的類SARS冠狀病毒來自2017年採集的舟山蝙蝠，2018年1月，它的基因序列由南京軍區軍事醫學研究所上傳至GenBank實現國際共享；目標病毒將與它的底版CoVZC45親緣關係最為接近，它們將同處冠狀病毒β譜系的同一分枝--BB亞群。

3. 選定可人際傳播的已知病毒

底版病毒CoVZC45不能感染人，不能使人致病；我們還需要一個可人際傳播的冠狀病毒，以提供可感染人的基因片斷。我們選定的這一病毒是SARS-CoV，即SARS病毒或者說非典病毒。SARS-CoV將為人工病毒提供一把進入人體細胞的“鑰匙”。

CoVZC45沒有進入人體細胞的鑰匙；而SARS-CoV則有與人體細胞受體匹配的鑰匙。

冠狀病毒的侵染，細胞內複製，釋放（擴散）示意圖

4. 合成可感染人的中間病毒。

S蛋白，也叫spike蛋白或刺突蛋白，就是圖中的紅色突起，它的前半部分S1蛋白決定冠狀病毒與人類受體（如ACE2）的結合能力。

中間病毒是一種嵌合病毒。簡單地說，用sars-cov的S1蛋白中決定與ACE2結合能力的RBD肽段（氨基酸長鏈），去替換CoVZC45的S1蛋白中的RBD肽段，得到的嵌合病毒，就是我們所需要的中間病毒。CoVZC45的S1蛋白不能與人體ACE2（血管緊張素轉換酶2）結合，所以它不能感染人；把CoVZC45的S1蛋白的RBD肽段替換成SARS-CoV的S1蛋白的RBD肽段後，得到的合成病毒，它的S1蛋白就獲得了與人類受體ACE2（相當於人類細胞的鎖）結合的能力，這意味着，我們已經用CoVZC45和SARS-CoV合成了一種能感染人的新病毒。

這一步工作，相當於用SARS-CoV的對人體有效的鑰匙，換掉CoVZC45原有的對人體無效的鑰匙，有了好用的新鑰匙，合成病毒就能侵入、感染人體細胞了。

如果把S1蛋白看成是打開細胞的鑰匙，那麼S1蛋白中的RBD（Receptor Binding Domain，受體結合域）肽段，就是鑰匙的鑰齒部位。RBD肽段在S蛋白中的位置見下圖。

上半圖：sars-cov-2的病毒序列構成示意圖；下半圖：sars-cov-2與COVZC45的S蛋白（spike蛋白，刺突蛋白）分解對照及各部分相似度。

5. 編輯中間病毒S1蛋白的RBD區段，對其進行同構替換。

中間病毒來自SARS-CoV的RBD肽段中，有五個重要的氨基酸殘基，也就是S蛋白的氨基酸序列中序號為第442、472、479、487、491的五個氨基酸殘基，它們位於S1蛋白與人體ACE2的接觸界面上，他們的空間位置、空間形態如同鑰匙齒面上五個至關重要的“鑰齒”，決定着S1蛋白能否與人類受體ACE2（相當於人類細胞的鎖）吻合匹配，結合在一起，也決定着病毒能否進入並感染人體細胞。

我們試圖在不喪失功能的前提下替換這五個殘基。經過反覆嘗試，我們為五個殘基中的前四個找到了替代者，這四個殘基被替換後，雖然病毒S1蛋白的五個關鍵部件中有四個已經變了，但它們的空間結構神奇地與改變前高度同構。實驗證明，替換了四個關鍵鹼基的中間病毒仍然可以與人體ACE2良好結合，輕鬆地侵入人體細胞。也就是說，我們為人造病毒找到了感染人體細胞的新鑰匙，這把新鑰匙的功效不比原來的鑰匙差。

Sars-cov與sars-cov-2，二種病毒S1蛋白的氨基酸序列比照，紅色對應相同的氨基酸（殘基），白色對應不同的氨基酸（殘基）。
可以觀察到兩點：a）在圖示區段，二種病毒相似度很高；b）在442、472、479、487四個位置上，二者的殘基不同，這正是上述同構替換帶來的改變。

換掉四個關鍵的氨基酸殘基前後，病毒的S1蛋白空間結構、形態高度相似，與ACE2的結合能力被有效保持。

以上的同構替換應該是本次人造病毒實驗最為精巧的環節。

2020年2月19日，Science雜誌刊發了美國德克薩斯大學奧斯汀分校Jason S McLellan團隊的一篇重磅論文《Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation》，其中的兩個發現是：
a. sars-cov-2與SARS病毒，表面刺突糖蛋白（S蛋白）結構上存在差異，但整體上看相似度很高；
b. 經過計算，sars-cov-2的S蛋白與人類血管緊張素轉化酶2（ACE2）的親和力，是SARS病毒S蛋白與ACE2之間親和力的10到20倍。這應該是新冠病毒的傳染性如此之強的原因之一。

2020年5月17日，澳大利亞弗林德斯大學的一個科學家小組在對比了Sars-cov-2與人體ACE2，與某些動物ACE2的親和性之後指出：sars-cov-2與人體ACE2的結合力，強過與可能的原始宿主動物（如蝙蝠）ACE2的結合力，也強過與可能的中間宿主動物ACE2的結合力；他們認為，這違反了病毒與新宿主的初始親和力應低於原宿主的常識。從他們的研究結果看，Sars-cov-2不象是來自動物，更象是專門為人類量身定製的。

6. 在S1、S2蛋白交界處精準插入超級強大的酶切位點

對S蛋白的第三項重大編輯是：在它的兩個亞基S1和S2對應的氨基酸序列的交界處，精確地“塞進”一個多鹼基酶切位點，這個酶切位點由四個氨基酸“RRAR”（對應12個鹼基）構成。

所“塞入”的這個“RRAR”序列符合Furin酶切位點的識別模式“RXXR”，可以被人類的弗林（furin）蛋白酶和其他蛋白酶識別，這些蛋白酶可以自此酶切位置對病毒的S蛋白進行切割，使刺突蛋白（S蛋白）的S1亞基與S2亞基分離。S1蛋白在細胞外被切割脫落後，S2蛋白將與人體細胞膜直接接觸，同時，病毒包膜也將緊貼人體細胞膜，二膜之間將發生“膜融合”，“膜融合”後，病毒包膜內的病毒RNA將被直接釋放入人體細胞，病毒RNA可立即在人體細胞內自我複製，組裝新病毒。

“膜融合”後直接向細胞內釋放病毒RNA示意圖

sars-cov沒有酶切位點，它不能在細胞膜外側與細胞膜發生膜融合；其S1蛋白與人類ACE2結合後，它將被整體“胞吞”入人類細胞，它的病毒RNA要等到S1、S2蛋白、包膜蛋白在細胞內被蛋白酶分解、溶化後，才能夠釋放出來，才能開啟在細胞內自我複製，組裝新病毒的過程。即，sars-cov感染細胞的過程是：
S1蛋白與人體細胞受體ACE2結合==>病毒被整個“胞吞”（囫圇吞棗）入人體細胞==>病毒的S1、S2蛋白，包膜蛋白在細胞內被蛋白酶分解、溶化==>病毒RNA被釋放出來==>RNA複製，組裝新病毒。

SARS-CoV“胞吞”與SARS-CoV-2“膜融合”對照圖


不難理解，sars-cov-2的“膜融合”感染方式，比sars-cov的“胞吞”感染方式，效率要高得多。

加入酶切位點，是sars-cov-2的一項重大功能優化，它的第一個重大效果是：賦予了sars-cov-2比sars-cov強得多的感染力、致病力、擴散力。


2020年2月4日，南開大學高山、阮吉壽等在中國預印本論文平台ChinaXiv發表了一篇題為《武漢2019冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點》的論文，這篇論文指出：此前發現的所有SARS和SARS樣（SARS-like）冠狀病毒都不具備新冠病毒（sars-cov-2）的酶切位點，這可能增強了新冠病毒的傳播能力。2019-nCoV（即SARS-CoV-2）的侵染效率是SARS-CoV的約100到1000倍。

酶切位點在β譜系冠狀病毒中極為少見，SARS-CoV，CoVZC45等病毒都沒有酶切位點，β譜系冠狀病毒中唯一具有酶切位點的是鼠肝炎冠狀病毒；所有與SARS-CoV-2刺突蛋白序列同源性大於40％的病毒都沒有弗林（furin）蛋白酶切割位點；有網友估算，CoVZC45恰在S1、S2蛋白交接處自然變異出furin酶切位點的幾率小於10的負60次方！以上多重證據證明，SARS-CoV-2的酶切位點不可能是自然變異產生的。

病毒界具有酶切位點的病毒，最著名的當屬HIV（艾滋病病毒）和埃博拉病毒。酶切位點在HIV、埃博拉等病毒致病機理中發揮的巨大作用，讓我們無法克制在人造病毒中加入酶切位點的衝動。

到這裡，就要說說酶切位點賦予人造病毒的第二個重大能力了：和HIV、埃博拉病毒一樣，該人造病毒也能重創人體免疫系統。機理是，當sars-cov-2和T細胞（人體的主要免疫細胞）接觸時，sars-cov-2能夠藉助高效的膜融合，侵入、摧毀T細胞，從而破壞人體免疫系統。這一能力當然也是sars-cov所不具備的。

4月7日，上海復旦大學研究組和紐約血液中心研究員姜世勃在論文醫學專刊《細胞分子免疫學》聯合發表的論文指出：
sars-cov-2會破壞免疫系統，使患者無法抵抗感染；
當sars-cov-2和T細胞相互接觸時，sars-cov-2將通過病毒膜和細胞膜的附着，將自己的RNA基因輸入T細胞，最終導致T細胞毀壞；
與HIV不同的是，sars-cov-2可能和T細胞一起死亡，進入T細胞的sars-cov-2不會擴散到T細胞外。

7. 在S蛋白中加入O-連接型聚糖結構，使病毒獲得逃避免疫打擊能力

我們還在這次基因改造病毒中加入了一個O-連接型聚糖結構。這一結構將和細胞表面的蛋白質相互作用，產生一個“粘蛋白樣結構域”，“粘蛋白樣結構域”能為sars-cov-2提供逃避人體免疫系統打擊的糖鏈屏障。籍着這一屏障，sars-cov-2可以隱蔽、持續地在人體內潛伏、複製，幾乎無所不至地向各個器官擴散，直至爆發；籍此，病毒還獲得了強悍的人體內適應生存能力，既能大大延緩人體觸發免疫反應，又難以被人體徹底清除或根除。

加入酶切位點和O-連接型聚糖結構，使sars-cov-2同時擁有了破壞人體免疫系統和逃避人體免疫系統打擊的雙重能力，為其強大致病力提供了雙保險。

O-連接型聚糖結構也是SARS-CoV或CoVZC45所不具備的。我們加入這一結構，是對埃博拉病毒類似結構的模仿。

8. 在N蛋白中加入非結構蛋白3A，進一步完善病毒免疫逃避能力。

非結構蛋白3A能使核衣殼蛋白（N蛋白，Nucleocapsid蛋白）具備VSR（RNAi抑制子）活性，使其可以有效對抗和反抑制由shRNAs（短髮夾RNA）或siRNAs（小分子干擾RNA）觸發的RNAi（RNA干擾）。在N蛋白中加入非結構蛋白3A後，RNAi這類通過干擾、抑制病毒RNA來促使病毒降解的免疫療法可能對SARS-CoV-2失效，這意味着，SARS-CoV-2的免疫逃避能力更多元和全面了。

酶切位點，O-連接型聚糖結構，非結構蛋白3A，集三大利器於一身。我們為SARS-CoV-2設計了全方位的抗免疫能力。

加入非結構蛋白3A，借鑑自中國科學院武漢病毒研究所2017年6月發表的一篇關於RNA干擾（RNAi）的論文，該論文研究、介紹了非結構蛋白3A的功能。

9. 對CoVZC45的輔助因子nsp7和E蛋白，不作任何編輯、改動

這是基於如下考慮：一，目前沒有修改二者的功能需要，不能沒事找事；二，我們對冠狀病毒的了解還遠沒達到透徹的程度，雖然已知，E蛋白同M蛋白、N蛋白一樣，都在正確組裝並釋放病毒過程中發揮重要作用，但目前，我們對E蛋白的工作機制還缺乏深入了解，以不作改動為宜。三，二者的基因序列都比較短，越短，反而修改難度越大。

E蛋白（包膜蛋白）對應的基因序列位置及E蛋白在病毒體上的位置

nsp7輔助因子對應的基因序列位置


10. 在人造病毒基因序列中嘗試其它無礙功能的修改

這些修改必須遵循以下規則：不能與之前的改造工作發生衝突；不破壞既定既有的病毒功能；改動之處在病毒基因序列中大致均勻地分布。

這些修改將有助於使病毒基因序列中的“變異”表現得比較平均、隨機、自然，模糊化之前的人工合成、編輯痕跡，使病毒看上去象是自然變異，自然演化產生的。

實事求是地說，現階段我們確實無法將病毒實現得足夠天然，那將帶來至少倍增的難度、工作量和時間。而且，有些修改並不是獨立的，有可能舉一發而動全身。在有限的時間內不可能盡善盡美，過度追求完美，結果將是什麼都做不成。

11. SARS-CoV-2帶有實驗室載體pShuttle的核苷酸序列INS1378

SARS-CoV-2的基因序列中，有一個長度為1378的核苷酸序列INS1378。它來自實驗室多功能載體pShuttle SN vector，是病毒製備、實驗過程中，將病毒與載體質粒重組時帶入病毒基因序列的。我們未能妥善地從SARS-CoV-2中消除這一明顯的實驗室痕跡。

12. SARS-CoV-2與底版病毒CoVZC45的一致性及差異分析

SARS-CoV-2與底版CoVZC45（舟山蝙蝠類SARS病毒）各部件的一致性情況如下：
E蛋白（及非結構蛋白nsp7亞基）的一致性是100%，
M蛋白（membrane膜蛋白）一致性是98.6%，
N蛋白（Nucleocapsid核殼蛋白）一致性是94%，
S2蛋白（spike刺突蛋白的後半部分）一致性是95%，
S1蛋白（spike蛋白的前半部分，決定病毒與人類ACE2能否結合的部分）的一致性（僅）為69%（因為我們對S1蛋白所做的嵌入、編輯最多啊）。

以上的一致性分布有二點明顯反常之處：
a. S蛋白的兩個亞基S1，S2分別發生了5%和31%的變異，但與S蛋白相鄰的E蛋白卻沒有任何協調性變異，這在自然演化情況下幾乎不可能發生。

b. 自然進化情況下，祖先（CoVZC45）與後代（SARS-CoV-2）之間基因序列上的差異應該大致均勻地分布，相對協調地產生，不應該出現僅某個部分大量變異，而其餘部分都高度穩定的情況。其他所有蛋白的一致性都>=94%，唯獨S1蛋白的一致性僅為69%，如此突兀的“自然變異”，在自然界很難找到先例。


===教程 End===


基於現有公開信息，從基因編輯之外的其它角度，我們同樣可以明確斷言：SARS-CoV-2是非自然產生的。請參閱我的上一篇相關文章“sars-cov-2（新冠）是實驗室生成的”。

真相不會一直被遮掩。

最有力量的語言是真相。

（正文完）

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