實驗室合成、編輯sars-cov-2簡明教程

送交者:  2020年06月07日14:28:41 於 [世界時事論壇] 發送悄悄話

本文要點

1. sars-cov-2是實驗室生成的；

2. 實驗室製造sars-cov-2的主要手段是基因編輯（基因合成也是一種基因編輯）；

3. 首先通過基因合成，得到一個中間病毒--一個嵌合的冠狀病毒。這個嵌合病毒的基因序列相當於把SARS-CoV的一段基因序列“粘貼到”CoVZC45基因序列的適當位置而得到的。

4. sars-cov-2不是單純的嵌合病毒。對上述嵌合病毒，還需要再做多處基因編輯，這些編輯將利用已有的生物遺傳學知識對病毒進行各種針對性優化，使新病毒集自然界多種病毒（包括非冠狀病毒）的優異特性於一身，從而比已有的任何冠狀病毒都更強大，更難以甄別，更難以抵禦，更難以醫治；

5. 功能性的基因編輯完成後，需對病毒基因序列大體均勻地嘗試不破壞既有功能的附加基因修改，儘可能模糊之前所做的人工合成與編輯痕跡，使人造病毒看上去更象是自然變異產生的。

關於CRISPR/Cas9

2012年，CRISPR/Cas9橫空問世，基因編輯技術得以突飛猛進，進入新的時代（第三代）。CRISPR/Cas9號稱“基因神剪”，它使之前艱深高難的基因編輯工作一下子變得設計簡單，操作便捷、高效可靠起來，其使用門檻、操作難度和成本也都大大降低，到2013年，它被迅速應用到生物、醫學、農業、環境等多個領域，造就了一批批科研奇蹟，這其中就包括2013年對冠狀病毒感染機制的重大發現。CRISPR/Cas9這一利器使基因編輯不再是一種高難技術，如果不考慮法律、安全和倫理、道德等因素，藉助CRISPR/Cas9，無論是編輯人類胚胎DNA，還是編輯冠狀病毒RNA，都不是一件很困難的事。

實驗室合成、編輯sars-cov-2簡明教程

0. 注意事項

請在符合安全等級的實驗室進行下述實驗，並嚴格遵守實驗室安全防護規程。

1. 實驗目標

我們的目標是製作一個β譜系的冠狀病毒，這個病毒後來被稱為SARS-CoV-2或新冠或2019-nCoV；

2. 選定基因改造用的底版病毒

目標病毒的基因序列將包含近3萬個鹼基對。作為新病毒的始創者，我們不能像後來的瑞士人那樣，從零開始拼裝這個新病毒，我們挑選了一個已存在的β譜系冠狀病毒CoVZC45作為改造底版，這樣可使基因改造工作量最小化。

CoVZC45，這一作為改造底版的類SARS冠狀病毒來自2017年採集的舟山蝙蝠，2018年1月，它的基因序列由南京軍區軍事醫學研究所上傳至GenBank實現國際共享；目標病毒將與它的底版CoVZC45親緣關係最為接近，它們將同處冠狀病毒β譜系的同一分枝--BB亞群。

3. 選定可人際傳播的已知病毒

CoVZC45不能感染人，從而不能使人致病；我們還需要一個可人際傳播的冠狀病毒，以提供可感染人的基因片斷。我們選定的這一病毒是SARS-CoV，即SARS病毒或者說非典病毒。SARS-CoV將為人工病毒提供一把進入人體細胞的“鑰匙”。

CoVZC45沒有進入人體細胞的鑰匙；SARS-CoV有與人體細胞膜受體匹配的鑰匙

冠狀病毒的侵染、複製、釋放（擴散）示意圖

4. 合成可感染人的中間病毒。

S蛋白，也叫spike蛋白或刺突蛋白，就是圖中的紅色突起，它的前半部分S1蛋白決定冠狀病毒與人類受體（如ACE2）的結合能力。

中間病毒是一種嵌合病毒。簡單地說，用sars-cov的S1蛋白中決定與ACE2結合能力的RBD肽段（氨基酸長鏈），去替換CoVZC45的S1蛋白中的RBD肽段，得到的嵌合病毒，就是我們所需要的中間病毒。CoVZC45的S1蛋白不能與人體ACE2（血管緊張素轉換酶2）結合，所以它不能感染人；把CoVZC45的S1蛋白的RBD肽段替換成SARS-CoV的S1蛋白的RBD肽段後，新得到的合成病毒，它的S1蛋白已具備了與人類受體ACE2（相當於人類細胞的鎖）結合的能力，這意味着，合成病毒已具備了感染人的能力。

這一步工作，相當於用SARS-CoV的對人體有效的鑰匙，換掉CoVZC45原有的對人體無效的鑰匙，得到新鑰匙的合成病毒就可以感染人了。RBD肽段在S蛋白中的位置見下圖。

上半圖：sars-cov-2的病毒序列構成示意圖；下半圖：sars-cov-2與COVZC45的S蛋白（spike蛋白，刺突蛋白）分解對照及各部分相似度。

5. 編輯中間病毒S1蛋白的RBD區段，對其進行同構替換。

中間病毒來自SARS-CoV的RBD肽段中有五個重要的氨基酸殘基，也就是S蛋白的氨基酸序列中序號為第442、472、479、487、491的五個氨基酸殘基，它們位於S1蛋白與人體ACE2的接觸界面上，他們的空間位置、形態就象鑰匙的齒面，決定着S1蛋白能否與人類受體ACE2（相當於人類細胞的鎖）吻合匹配，結合在一起，也決定着病毒能否進入並感染人體細胞。

我們試圖在不喪失功能的前提下替換這五個殘基。經過反覆嘗試，我們為五個殘基中的前四個找到了替代者，這四個殘基被替換後，雖然病毒S1蛋白的五個關鍵部件中有四個已經變了，但它們的空間結構神奇地與改變前高度同構。實驗證明，替換了四個關鍵鹼基的中間病毒仍然可以與人體ACE2良好結合，輕鬆地侵入人體細胞。也就是說，我們為人造病毒找到了感染人體細胞的新鑰匙，這把新鑰匙的功效不比原來的鑰匙差。

Sars-cov與sars-cov-2，二者S1蛋白的氨基酸序列比照，紅色表示相同的氨基酸（殘基），白色為不同的氨基酸（殘基），二者442、472、479、487四個位置上的殘基不同，這是上述同構替換的結果。

換掉四個關鍵的氨基酸殘基前後，病毒的S1蛋白空間結構、形態高度相似。

以上的同構替換應該是本次人造病毒實驗最為精巧的環節。

2020年2月19日，Science雜誌刊發了美國德克薩斯大學奧斯汀分校Jason S McLellan團隊的一篇重磅論文《Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation》，其中的兩個發現是：

a. sars-cov-2與SARS病毒，表面刺突糖蛋白（S蛋白）結構上存在差異，但整體上看相似度很高；

b. 經過計算，sars-cov-2的S蛋白與人類血管緊張素轉化酶2（ACE2）的親和力，是SARS病毒S蛋白與ACE2之間親和力的10到20倍。這應該是新冠病毒的傳染性如此之強的原因之一。

2020年5月17日，澳大利亞弗林德斯大學的一個科學家小組在對比了Sars-cov-2與人體ACE2，與某些動物ACE2的親和性之後指出：sars-cov-2與人體ACE2的結合力，強過與可能的原始宿主動物（如蝙蝠）ACE2的結合力，也強過與可能的中間宿主動物ACE2的結合力；他們認為，這違反了病毒與新宿主的初始親和力應低於原宿主的常識。從他們的研究結果看，Sars-cov-2不象是來自動物體內，更象是專門為人類量身定製的。

6. 在S1、S2蛋白交界處精準插入超級強大的酶切位點

對S蛋白的第三項重大編輯是：在它的兩個亞基S1和S2對應的氨基酸序列的交界處，精確地“塞進”一個多鹼基酶切位點，這個酶切位點由四個氨基酸“RRAR”（對應12個鹼基）構成。

所“塞入”的這個“RRAR”序列符合Furin酶切位點的識別模式“RXXR”，可以被人類的弗林（furin）蛋白酶和其他蛋白酶識別，這些蛋白酶可以自此酶切位置對病毒的S蛋白進行切割，使刺突蛋白（S蛋白）的S1亞基與S2亞基分離。S1蛋白在細胞外被切割脫落後，S2蛋白將與人體細胞膜直接接觸，同時，病毒包膜也將緊貼人體細胞膜，二膜之間將發生“膜融合”，“膜融合”後，病毒包膜內的病毒RNA可被直接釋放入人體細胞，在人體細胞內開始自我複製，組裝新的病毒。

“膜融合”後直接向細胞內釋放病毒RNA示意圖

sars-cov沒有酶切位點，它不能在細胞膜外側與細胞膜發生膜融合；其S1蛋白與人類ACE2結合後，它將被整體“胞吞”入人類細胞，它的病毒RNA要等到S1、S2蛋白、包膜蛋白在細胞內被蛋白酶分解、溶化後，才能夠釋放出來。即，sars-cov感染細胞的過程是：

S1蛋白與人體細胞受體ACE2結合==>病毒被人體細胞整個“胞吞”==>病毒的S1、S2蛋白，包膜蛋白在細胞內被蛋白酶分解、溶化==>病毒RNA被釋放出來==>RNA複製，組裝新病毒。

不難理解，sars-cov-2的“膜融合”感染方式，比sars-cov的“胞吞”感染方式，效率要高得多。

加入酶切位點，是sars-cov-2的重大功能優化，它的第一個重大效果是：賦予了sars-cov-2比sars-cov強得多的感染力、致病力。

SARS-CoV“胞吞”與SARS-CoV-2“膜融合”對照圖

2020年2月4日，南開大學高山、阮吉壽等在中國預印本ChinaXiv發表了一篇題為《武漢2019冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點》的論文，這篇論文指出：2019-nCoV（即sars-cov-2）的侵染效率是sars的約100到1000倍。

酶切位點在β譜系冠狀病毒中極為少見，sars-cov，CoVZC45等病毒都沒有酶切位點，β譜系冠狀病毒中唯一具有酶切位點的是鼠肝炎冠狀病毒；所有與sars-cov-2刺突序列同源性大於40％的病毒都沒有弗林蛋白酶切割位點；有網友估算，由CoVZC45自然變異出furin酶切點的幾率小於10的負60次方！這些都說明，sars-cov-2的酶切位點不可能是自然變異產生的。

病毒界具有酶切位點的病毒，還有著名的HIV（艾滋病病毒）、埃博拉病毒。我們在人造病毒中加入酶切位點，正是借鑑了HIV、埃博拉等病毒的類似基因結構。

這一借鑑也繼承了HIV等病毒對免疫系統的破壞力。由於酶切位點的存在，藉助高效的膜融合，sars-cov-2還能入侵、毀壞人類主要免疫細胞T細胞，從而破壞人體免疫系統。

4月中旬，一個來自中國上海復旦大學和紐約血液中心的聯合研究小組在《細胞與分子免疫》雜誌上發表文章，指出：

sars-cov-2會破壞免疫系統，使患者無法抵抗感染；

當sars-cov-2和T細胞相互接觸時，通過病毒膜和細胞膜的附着，sars-cov-2的RNA基因進入了T細胞，使其不堪重負，失去了保護身體的能力；

死於COVID-19的患者的身體受損情況與SARS和HIV相似；

與HIV不同的是，進入T細胞的sars-cov-2不會擴散到T細胞外，T細胞和sars-cov-2可能一起死亡。

7. 在S蛋白中加入O-連接型聚糖結構使病毒獲得逃避免疫打擊能力

我們還在這次基因改造病毒中加入了一個O-連接型聚糖結構，它可以與細胞表面的蛋白質相互作用，產生一個“粘蛋白樣結構域”，這個“粘蛋白樣結構域”可以成為sars-cov-2逃避人體免疫系統打擊的糖鏈屏障。這樣，sars-cov-2就具備了極高的隱蔽性、潛伏性、強大的人體適應生存能力，既不容易在病毒入侵早期觸發免疫反應，又難以根除。

這一結構同樣是sars和CoVZC45所不具備的。我們所加入的這一結構，模仿自埃博拉病毒的類似結構。

8. 在N蛋白基因序列中加入非結構蛋白3A，進一步增強病毒免疫逃避能力。

加入了非結構蛋白3A的核衣殼蛋白（N蛋白）將具有VSR（RNAi抑制子）活性，能有效抑制和對抗shRNAs或siRNAs觸發的RNAi（RNA干擾），使RNAi干擾免疫療法對人造病毒失效，人造病毒因此進一步提高了自身免疫逃避能力。

這一技術借鑑了中國科學院武漢病毒研究所2017年6月的一篇論文中關於RNA干擾（RNAi）的研究成果。

9. 完全保留輔助因子nsp7及E蛋白基因序列，不作任何改動

目前沒有修改二者的需要；我們已知E蛋白同M蛋白、N蛋白一樣，都是正確組裝並釋放病毒所必需的，但目前對E蛋白的詳細機制還不明了，不宜輕易修改。

E蛋白（包膜蛋白）對應的基因序列位置及E蛋白在病毒體上的位置

nsp7輔助因子對應的基因序列位置

10. 在人造病毒基因序列中嘗試各種無礙功能的修改

這些修改必須以不破壞既有的病毒功能為前提，應大體均勻地分布，以儘可能模糊病毒的人工合成與編輯痕跡，使它看上去更象是自然變異產生的，使整個基因序列中的“變異”顯得比較平均、隨機、自然。

但是，現階段我們無法將病毒實現得足夠天然，那將至少帶來成倍增加的難度、工作量和時間。而且，有些修改並不是獨立的，有可能舉一發而動全身。在有限的時間內不可能盡善盡美，過度追求完美，結果將是什麼都做不成。

11. sars-cov-2與載體發生基因重組，插入了肽段INS1378

我們發現，實驗過程中，人造病毒sars-cov-2將不可避免地與病毒載體pShuttle SN vector（用於冠狀病毒研究，及相關疫苗研製、開發）發生基因重組，導致pShuttle SN vector基因序列中一個長度為1378個核苷酸序列的INS1378肽段被編組入sars-cov-2的基因序列。目前，我們還尚未找到從sars-cov-2中消除這一實驗室痕跡的辦法。

12. 人造病毒的整體一致性回顧

現階段我們得到的人造病毒sars-cov-2整體上還有欠自然、協調。對比一下該病毒與它的底版舟山蝙蝠病毒CoVZC45的一致性：E蛋白（及非結構蛋白nsp7亞基）的一致性是100%，N蛋白（Nucleocapsid核殼蛋白）一致性是94%，M蛋白（membrane膜蛋白）一致性是98.6%，S2蛋白（spike刺突蛋白的後半部分）是95%，S1蛋白（spike蛋白的前半部分，決定病毒與人類ACE2能否結合的部分）的一致性僅為69%（我們對S1蛋白所做的嵌入、編輯最多）。

以上的一致性情況有二個明顯反常：

a. S蛋白的兩個亞基S1，S2分別發生了5%和31%的變異，但與S蛋白相鄰的E蛋白卻沒有任何變化，這在自然變異的情況下幾乎是不可能的。

b. 自然進化情況下，祖先（CoVZC45）與後代（sars-cov-2）之間基因序列上的差異應該大致均勻地分布，不應該出現某個部分差異很大，其餘部分高度相似的巨大反差。兩個病毒S1蛋白的一致性僅為69%，而它們其他所有蛋白的一致性都>=94%，這從自然變異的角度來說也是極不正常的。

===教程 End===

基於現有公開信息，從基因編輯之外的其它角度，我們也可以明確斷定：sars-cov-2是非自然產生的。關於此點，請參閱我的另一文章“sars-cov-2（新冠）是實驗室生成的”。

真相不會一直被遮掩。

最有力量的語言是真相。