实验室合成、编辑sars-cov-2简明教程

送交者:  2020年06月07日14:28:41 于 [世界时事论坛] 发送悄悄话

本文要点

1. sars-cov-2是实验室生成的；

2. 实验室制造sars-cov-2的主要手段是基因编辑（基因合成也是一种基因编辑）；

3. 首先通过基因合成，得到一个中间病毒--一个嵌合的冠状病毒。这个嵌合病毒的基因序列相当于把SARS-CoV的一段基因序列“粘贴到”CoVZC45基因序列的适当位置而得到的。

4. sars-cov-2不是单纯的嵌合病毒。对上述嵌合病毒，还需要再做多处基因编辑，这些编辑将利用已有的生物遗传学知识对病毒进行各种针对性优化，使新病毒集自然界多种病毒（包括非冠状病毒）的优异特性于一身，从而比已有的任何冠状病毒都更强大，更难以甄别，更难以抵御，更难以医治；

5. 功能性的基因编辑完成后，需对病毒基因序列大体均匀地尝试不破坏既有功能的附加基因修改，尽可能模糊之前所做的人工合成与编辑痕迹，使人造病毒看上去更象是自然变异产生的。

关于CRISPR/Cas9

2012年，CRISPR/Cas9横空问世，基因编辑技术得以突飞猛进，进入新的时代（第三代）。CRISPR/Cas9号称“基因神剪”，它使之前艰深高难的基因编辑工作一下子变得设计简单，操作便捷、高效可靠起来，其使用门槛、操作难度和成本也都大大降低，到2013年，它被迅速应用到生物、医学、农业、环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，这其中就包括2013年对冠状病毒感染机制的重大发现。CRISPR/Cas9这一利器使基因编辑不再是一种高难技术，如果不考虑法律、安全和伦理、道德等因素，借助CRISPR/Cas9，无论是编辑人类胚胎DNA，还是编辑冠状病毒RNA，都不是一件很困难的事。

实验室合成、编辑sars-cov-2简明教程

0. 注意事项

请在符合安全等级的实验室进行下述实验，并严格遵守实验室安全防护规程。

1. 实验目标

我们的目标是制作一个β谱系的冠状病毒，这个病毒后来被称为SARS-CoV-2或新冠或2019-nCoV；

2. 选定基因改造用的底版病毒

目标病毒的基因序列将包含近3万个碱基对。作为新病毒的始创者，我们不能像后来的瑞士人那样，从零开始拼装这个新病毒，我们挑选了一个已存在的β谱系冠状病毒CoVZC45作为改造底版，这样可使基因改造工作量最小化。

CoVZC45，这一作为改造底版的类SARS冠状病毒来自2017年采集的舟山蝙蝠，2018年1月，它的基因序列由南京军区军事医学研究所上传至GenBank实现国际共享；目标病毒将与它的底版CoVZC45亲缘关系最为接近，它们将同处冠状病毒β谱系的同一分枝--BB亚群。

3. 选定可人际传播的已知病毒

CoVZC45不能感染人，从而不能使人致病；我们还需要一个可人际传播的冠状病毒，以提供可感染人的基因片断。我们选定的这一病毒是SARS-CoV，即SARS病毒或者说非典病毒。SARS-CoV将为人工病毒提供一把进入人体细胞的“钥匙”。

CoVZC45没有进入人体细胞的钥匙；SARS-CoV有与人体细胞膜受体匹配的钥匙

冠状病毒的侵染、复制、释放（扩散）示意图

4. 合成可感染人的中间病毒。

S蛋白，也叫spike蛋白或刺突蛋白，就是图中的红色突起，它的前半部分S1蛋白决定冠状病毒与人类受体（如ACE2）的结合能力。

中间病毒是一种嵌合病毒。简单地说，用sars-cov的S1蛋白中决定与ACE2结合能力的RBD肽段（氨基酸长链），去替换CoVZC45的S1蛋白中的RBD肽段，得到的嵌合病毒，就是我们所需要的中间病毒。CoVZC45的S1蛋白不能与人体ACE2（血管紧张素转换酶2）结合，所以它不能感染人；把CoVZC45的S1蛋白的RBD肽段替换成SARS-CoV的S1蛋白的RBD肽段后，新得到的合成病毒，它的S1蛋白已具备了与人类受体ACE2（相当于人类细胞的锁）结合的能力，这意味着，合成病毒已具备了感染人的能力。

这一步工作，相当于用SARS-CoV的对人体有效的钥匙，换掉CoVZC45原有的对人体无效的钥匙，得到新钥匙的合成病毒就可以感染人了。RBD肽段在S蛋白中的位置见下图。

上半图：sars-cov-2的病毒序列构成示意图；下半图：sars-cov-2与COVZC45的S蛋白（spike蛋白，刺突蛋白）分解对照及各部分相似度。

5. 编辑中间病毒S1蛋白的RBD区段，对其进行同构替换。

中间病毒来自SARS-CoV的RBD肽段中有五个重要的氨基酸残基，也就是S蛋白的氨基酸序列中序号为第442、472、479、487、491的五个氨基酸残基，它们位于S1蛋白与人体ACE2的接触界面上，他们的空间位置、形态就象钥匙的齿面，决定着S1蛋白能否与人类受体ACE2（相当于人类细胞的锁）吻合匹配，结合在一起，也决定着病毒能否进入并感染人体细胞。

我们试图在不丧失功能的前提下替换这五个残基。经过反复尝试，我们为五个残基中的前四个找到了替代者，这四个残基被替换后，虽然病毒S1蛋白的五个关键部件中有四个已经变了，但它们的空间结构神奇地与改变前高度同构。实验证明，替换了四个关键碱基的中间病毒仍然可以与人体ACE2良好结合，轻松地侵入人体细胞。也就是说，我们为人造病毒找到了感染人体细胞的新钥匙，这把新钥匙的功效不比原来的钥匙差。

Sars-cov与sars-cov-2，二者S1蛋白的氨基酸序列比照，红色表示相同的氨基酸（残基），白色为不同的氨基酸（残基），二者442、472、479、487四个位置上的残基不同，这是上述同构替换的结果。

换掉四个关键的氨基酸残基前后，病毒的S1蛋白空间结构、形态高度相似。

以上的同构替换应该是本次人造病毒实验最为精巧的环节。

2020年2月19日，Science杂志刊发了美国德克萨斯大学奥斯汀分校Jason S McLellan团队的一篇重磅论文《Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation》，其中的两个发现是：

a. sars-cov-2与SARS病毒，表面刺突糖蛋白（S蛋白）结构上存在差异，但整体上看相似度很高；

b. 经过计算，sars-cov-2的S蛋白与人类血管紧张素转化酶2（ACE2）的亲和力，是SARS病毒S蛋白与ACE2之间亲和力的10到20倍。这应该是新冠病毒的传染性如此之强的原因之一。

2020年5月17日，澳大利亚弗林德斯大学的一个科学家小组在对比了Sars-cov-2与人体ACE2，与某些动物ACE2的亲和性之后指出：sars-cov-2与人体ACE2的结合力，强过与可能的原始宿主动物（如蝙蝠）ACE2的结合力，也强过与可能的中间宿主动物ACE2的结合力；他们认为，这违反了病毒与新宿主的初始亲和力应低于原宿主的常识。从他们的研究结果看，Sars-cov-2不象是来自动物体内，更象是专门为人类量身定制的。

6. 在S1、S2蛋白交界处精准插入超级强大的酶切位点

对S蛋白的第三项重大编辑是：在它的两个亚基S1和S2对应的氨基酸序列的交界处，精确地“塞进”一个多碱基酶切位点，这个酶切位点由四个氨基酸“RRAR”（对应12个碱基）构成。

所“塞入”的这个“RRAR”序列符合Furin酶切位点的识别模式“RXXR”，可以被人类的弗林（furin）蛋白酶和其他蛋白酶识别，这些蛋白酶可以自此酶切位置对病毒的S蛋白进行切割，使刺突蛋白（S蛋白）的S1亚基与S2亚基分离。S1蛋白在细胞外被切割脱落后，S2蛋白将与人体细胞膜直接接触，同时，病毒包膜也将紧贴人体细胞膜，二膜之间将发生“膜融合”，“膜融合”后，病毒包膜内的病毒RNA可被直接释放入人体细胞，在人体细胞内开始自我复制，组装新的病毒。

“膜融合”后直接向细胞内释放病毒RNA示意图

sars-cov没有酶切位点，它不能在细胞膜外侧与细胞膜发生膜融合；其S1蛋白与人类ACE2结合后，它将被整体“胞吞”入人类细胞，它的病毒RNA要等到S1、S2蛋白、包膜蛋白在细胞内被蛋白酶分解、溶化后，才能够释放出来。即，sars-cov感染细胞的过程是：

S1蛋白与人体细胞受体ACE2结合==>病毒被人体细胞整个“胞吞”==>病毒的S1、S2蛋白，包膜蛋白在细胞内被蛋白酶分解、溶化==>病毒RNA被释放出来==>RNA复制，组装新病毒。

不难理解，sars-cov-2的“膜融合”感染方式，比sars-cov的“胞吞”感染方式，效率要高得多。

加入酶切位点，是sars-cov-2的重大功能优化，它的第一个重大效果是：赋予了sars-cov-2比sars-cov强得多的感染力、致病力。

SARS-CoV“胞吞”与SARS-CoV-2“膜融合”对照图

2020年2月4日，南开大学高山、阮吉寿等在中国预印本ChinaXiv发表了一篇题为《武汉2019冠状病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位点》的论文，这篇论文指出：2019-nCoV（即sars-cov-2）的侵染效率是sars的约100到1000倍。

酶切位点在β谱系冠状病毒中极为少见，sars-cov，CoVZC45等病毒都没有酶切位点，β谱系冠状病毒中唯一具有酶切位点的是鼠肝炎冠状病毒；所有与sars-cov-2刺突序列同源性大于40％的病毒都没有弗林蛋白酶切割位点；有网友估算，由CoVZC45自然变异出furin酶切点的几率小于10的负60次方！这些都说明，sars-cov-2的酶切位点不可能是自然变异产生的。

病毒界具有酶切位点的病毒，还有著名的HIV（艾滋病病毒）、埃博拉病毒。我们在人造病毒中加入酶切位点，正是借鉴了HIV、埃博拉等病毒的类似基因结构。

这一借鉴也继承了HIV等病毒对免疫系统的破坏力。由于酶切位点的存在，借助高效的膜融合，sars-cov-2还能入侵、毁坏人类主要免疫细胞T细胞，从而破坏人体免疫系统。

4月中旬，一个来自中国上海复旦大学和纽约血液中心的联合研究小组在《细胞与分子免疫》杂志上发表文章，指出：

sars-cov-2会破坏免疫系统，使患者无法抵抗感染；

当sars-cov-2和T细胞相互接触时，通过病毒膜和细胞膜的附着，sars-cov-2的RNA基因进入了T细胞，使其不堪重负，失去了保护身体的能力；

死于COVID-19的患者的身体受损情况与SARS和HIV相似；

与HIV不同的是，进入T细胞的sars-cov-2不会扩散到T细胞外，T细胞和sars-cov-2可能一起死亡。

7. 在S蛋白中加入O-连接型聚糖结构使病毒获得逃避免疫打击能力

我们还在这次基因改造病毒中加入了一个O-连接型聚糖结构，它可以与细胞表面的蛋白质相互作用，产生一个“粘蛋白样结构域”，这个“粘蛋白样结构域”可以成为sars-cov-2逃避人体免疫系统打击的糖链屏障。这样，sars-cov-2就具备了极高的隐蔽性、潜伏性、强大的人体适应生存能力，既不容易在病毒入侵早期触发免疫反应，又难以根除。

这一结构同样是sars和CoVZC45所不具备的。我们所加入的这一结构，模仿自埃博拉病毒的类似结构。

8. 在N蛋白基因序列中加入非结构蛋白3A，进一步增强病毒免疫逃避能力。

加入了非结构蛋白3A的核衣壳蛋白（N蛋白）将具有VSR（RNAi抑制子）活性，能有效抑制和对抗shRNAs或siRNAs触发的RNAi（RNA干扰），使RNAi干扰免疫疗法对人造病毒失效，人造病毒因此进一步提高了自身免疫逃避能力。

这一技术借鉴了中国科学院武汉病毒研究所2017年6月的一篇论文中关于RNA干扰（RNAi）的研究成果。

9. 完全保留辅助因子nsp7及E蛋白基因序列，不作任何改动

目前没有修改二者的需要；我们已知E蛋白同M蛋白、N蛋白一样，都是正确组装并释放病毒所必需的，但目前对E蛋白的详细机制还不明了，不宜轻易修改。

E蛋白（包膜蛋白）对应的基因序列位置及E蛋白在病毒体上的位置

nsp7辅助因子对应的基因序列位置

10. 在人造病毒基因序列中尝试各种无碍功能的修改

这些修改必须以不破坏既有的病毒功能为前提，应大体均匀地分布，以尽可能模糊病毒的人工合成与编辑痕迹，使它看上去更象是自然变异产生的，使整个基因序列中的“变异”显得比较平均、随机、自然。

但是，现阶段我们无法将病毒实现得足够天然，那将至少带来成倍增加的难度、工作量和时间。而且，有些修改并不是独立的，有可能举一发而动全身。在有限的时间内不可能尽善尽美，过度追求完美，结果将是什么都做不成。

11. sars-cov-2与载体发生基因重组，插入了肽段INS1378

我们发现，实验过程中，人造病毒sars-cov-2将不可避免地与病毒载体pShuttle SN vector（用于冠状病毒研究，及相关疫苗研制、开发）发生基因重组，导致pShuttle SN vector基因序列中一个长度为1378个核苷酸序列的INS1378肽段被编组入sars-cov-2的基因序列。目前，我们还尚未找到从sars-cov-2中消除这一实验室痕迹的办法。

12. 人造病毒的整体一致性回顾

现阶段我们得到的人造病毒sars-cov-2整体上还有欠自然、协调。对比一下该病毒与它的底版舟山蝙蝠病毒CoVZC45的一致性：E蛋白（及非结构蛋白nsp7亚基）的一致性是100%，N蛋白（Nucleocapsid核壳蛋白）一致性是94%，M蛋白（membrane膜蛋白）一致性是98.6%，S2蛋白（spike刺突蛋白的后半部分）是95%，S1蛋白（spike蛋白的前半部分，决定病毒与人类ACE2能否结合的部分）的一致性仅为69%（我们对S1蛋白所做的嵌入、编辑最多）。

以上的一致性情况有二个明显反常：

a. S蛋白的两个亚基S1，S2分别发生了5%和31%的变异，但与S蛋白相邻的E蛋白却没有任何变化，这在自然变异的情况下几乎是不可能的。

b. 自然进化情况下，祖先（CoVZC45）与后代（sars-cov-2）之间基因序列上的差异应该大致均匀地分布，不应该出现某个部分差异很大，其余部分高度相似的巨大反差。两个病毒S1蛋白的一致性仅为69%，而它们其他所有蛋白的一致性都>=94%，这从自然变异的角度来说也是极不正常的。

===教程 End===

基于现有公开信息，从基因编辑之外的其它角度，我们也可以明确断定：sars-cov-2是非自然产生的。关于此点，请参阅我的另一文章“sars-cov-2（新冠）是实验室生成的”。

真相不会一直被遮掩。

最有力量的语言是真相。