王曉東成名的核心成果是細胞色素C的發現。其他的成果可以看成是在這個發現的基礎
上的上下游的擴展。
對於這個細胞色素C的發現，基本方法是王曉東拿細胞抽提掖過多個層析柱分離蛋白，
檢測活性峰，最後得到比較純的活性蛋白，發現是細胞色素C。
這種screen蛋白的思路，是70-80年代沒有基因screen技術的時候非常流行的技術，很
多重要蛋白都是這樣發現的。
對於這些screen的實驗，更依賴於運氣而不是idea，因為你不知道你能得到什麼，只能
拿最後得到的東西去分析結果。試想如果apoptosis中本來就沒有細胞色素C的參與，王
曉東現在可能還是一個普通faculty。或者王曉東晚兩年動手，就可能有別人做出來。
個人認為這裡有點把王曉東神話了。具體說來王曉東的idea，並不一定比其他的人高出
一等。
現在是分子生物學的時代，似乎大家都對那些耗時費力的純化實驗不屑一顧。王曉東自
己也說過，做好的science要比較“傻”的人才行。說到底還是一個研究方法的問題，
我們只能從實驗得到的現象來學習下一步實驗該往那裡走，而不是用現在已知的模型去
fit你的數據，如果天天想着耍小聰明，找捷徑，最後可能一事無成。王曉東的成功可
能有很多運氣的成分，但是這種研究方法卻是現在大多數人都缺乏的。一個好的實驗方
法是很難用落伍不落伍來形容的，有很多用了幾十年的實驗方法，在今天看來仍然是經
典。
能把經典的手段運用到極致，在這個領域能做到這一點的少得很；為什麼是王曉東挖到
這座金礦而不是其他人。我不覺得這裡有神話王曉東的意思，他就是調亡領域裡首屈一
指的大牛。
相對於研究方法來說，選定研究方向更為重要。王小東的成功很大程度上是因為他選了凋
亡機制這個重要的方向，再加上機遇和運氣他後面要做的RNAi機制的研究方向無疑也是很
重要的。
Stanley J. Korsmeyer， 和王教授是研究類似問題的，用不同的多樣的方法，對該
領域的貢獻尚在王教授之上。他發論文的速度是王教授無法相比的，不想說他更優
秀，但不可否認，研究手段的差別是一個重要因素。
基於活性介導的活性成分分離? assay-based active componnent purification
這個思路是很經典的思路，同時另外一個意思就是很老套的思路。
前面有人說得很對，最重要的是在合適的時間選對了合適的方向，至於具體的技術、思
路，很多都是常規的。
比如Watson和Crick發現DNA double helix結構，就是在合適的時間選擇了合適的方向
的經典的例子。當時蛋白的二級結構已經發現，結晶學技術也有突破，亟待解決DNA的
二級結構的問題，當時Pauling等大牛都在做，可以說，如果Watson 和Crick沒發表他
們的結構的話，這個問題基本上也大致能在六十年代得到解決。當然，不能排除天才科
學家的貢獻，但是具體誰做出成果，有時也有一定的運氣成分。
我的理解是，各方面的研究基礎、工具基本具備，該領域文獻數最少，有足夠眼光認識
其長遠的價值，這個時候就看誰開始撈第一桶金了。
生物實驗更多的是扎紮實實的體力活，是bench work。要貫徹一個好的課題，很多時間
都是花在如何解決實驗細節上的。如果做學生的一開始就想要做哲學高度的idea，往往
會竹籃打水一場空。
做任何事情，如果能把一件事情做深，研究透，不說功成名就，混口飯吃就比較容
易了。
標 題: 王曉東的科研思路追蹤(綜述）
發信人: toptip (老君)
本文是我在博士階段寫的基礎綜述。這篇綜述花了我相當長的時間，我看了王曉東實
驗室所有的文章，甚至將他講課的故事和他E-mail給我的essay都揉了進來，思路是理
清楚了，語言卻還是晦澀的，有些甚至是賣弄的和誇張的。本來想着有時間再整理潤色
一下，然而交差之後一年過去了，這篇文章卻仍然躺在電腦的某個角落。
我相信對王曉東感興趣的人很多，卻少有人真正去研究他的文獻，理解他的工作思
路。儘管文字晦澀，相信感興趣的人還是能從這篇綜述中獲得某些信息。物該盡其用，
把它貼出來，權當獻給Biology板的聖誕禮物吧。
凋亡的線粒體途徑
－王曉東的科研思路追蹤
關鍵詞：調亡、程序性死亡、線粒體、caspase、王曉東
摘要：凋亡的線粒體途徑是生物學界闡明得最為明確的信號通路之一，是發展最為迅速
的領域之一。在此領域中貢獻最大的當屬華人科學家王曉東。他利用經典的生化技術無
可辯駁地發現並梳理了這一通路。本文通過系統研究王曉東的論文，試圖追蹤王曉東的
科研思路，並以此為主，再現這一領域激動人心的發現歷程。
故事外的故事
四年前，我在走進教室的時候碰到了風塵僕僕的王曉東。王穿着灰色調的衣褲，背着一
個很土的綠包，身體不是很挺拔，臉寬大且稜角分明，要不是走路的時候有一些堅定，
很容易被別人當作進城的打工漢。他從最簡單的開始講起，科研需要三板斧，要是能掌
握兩板也不錯……漸漸地教室的氣氛有點反常，好像大家都在屏息一樣：他在講他和學
生劉雪松進行純化蛋白比賽的故事……及至他用漂亮的數據圖將結果展現給我們的時候
，我們才象聽了一次武俠傳奇一樣如夢方醒。
王循序漸進、清晰明了、講故事般的授課方式給我留下了很深的印象。為了加深這種印
象，兩年之後我又和師弟師妹們一起再次聽了他的課。而當時我剛好有純化一個未知因
子的打算，於是我瀏覽了他的實驗室主頁。在我粗粗翻閱了他發表的文獻之後，我驚奇
地發現他的重要發現基本上都是用“建立體外檢測體系－跟蹤純化活性”的模式進行的
。我對這一模式的有效性產生了很大的興趣。當我在博士三年級被要求寫綜述的時候，
我決定研究他的論文，把這一模式徹底搞清楚。
從博士後研究開始-技術訓練與選題的由來
1991-1995年，王曉東在美國德克薩斯大學西南醫學中心進行博士後訓練，師從諾貝爾
獎獲得者Joseph L. Goldstein 和 Michael S. Brown教授，從事膽固醇調節基因的表
達調控的研究。1993年，王和他的同事利用gel shift assay跟蹤純化，從Hela細胞核
中分離出了與低密度脂蛋白promotor的調控序列相結合的蛋白SREBPs1,2。這是王最早
操練“體外assay跟蹤純化進程”的方法，王正是利用這種方法隨後在凋亡領域做出了
一系列令人炫目的實驗。
SREBPs是膜定位蛋白，它的膜結合域被蛋白酶切除後，才能進入核內，調控低密度脂蛋
白的表達。基於SREBPs被細胞裂解液中的蛋白酶活性切為兩個片斷的現象，王曉東建立
了體外assay，跟蹤活性，通過不同性質的一系列純化柱，部分（partially）純化到了
這個蛋白。對蛋白的兩個片斷序列分析表明它與後來統一命名的Caspase 3 (cysteine-
containing aspartate-spicific protease)同源3。而之後的實驗表明Caspase 3本身
在細胞凋亡中也能夠剪切SREBPs，凋亡通路通過這種方式干擾膜蛋白的代謝，從而導致
細胞膜泡狀化（blebbing）4。研究的不斷深入將王曉東的目光從膽固醇調節基因轉向
了凋亡。
傳奇的前奏-細胞調亡的研究背景
細胞凋亡是由基因編碼控制的程序化死亡。凋亡的細胞形態上發生很大的改變：胞體變
小，胞漿濃縮，核染色質密度增高，細胞膜內陷形成凋亡小體等。最後凋亡的細胞被巨
噬細胞吞噬而消亡。細胞凋亡在胚胎發生過程負責清除多餘的細胞。在當時，人們用遺
傳學的方法鑑定了三個控制線蟲發育過程中細胞凋亡的基因：ced-9 ，ced-3和ced-4。
基因ced-9編碼的蛋白抑制細胞凋亡，已知它在人中對應的蛋白是bcl-2；而ced-3和ced
-4編碼的蛋白則促進細胞凋亡。其中ced-3基因編碼一種富含絲氨酸的蛋白酶。1993年
，復旦畢業的華人學生袁鈞英用蛋白序列分段檢索的辦法巧妙地找到了ced-3蛋白在人
中的同源蛋白：它們隸屬於ICE（interleukin-1-converting enzyme）蛋白酶家族5。
其中caspase 3 的序列和功能與ced-3最為接近。Caspase 3特異地在天冬氨酸殘基的位
置剪切底物蛋白（比如前面說的SREBPs），而自己本身在細胞凋亡中也在天冬氨酸的位
置被剪切為兩個片斷。人們推斷有一個caspase級聯（cascade）放大的過程控制凋亡的
發生。當時生物學界蓄勢待發，很多生物學家都醞釀着回答這個問題：細胞是通過什麼
途徑執行凋亡程序的6。
核心故事－凋亡體（apoptosome）的發現
1995年王曉東完成博士後訓練，組建了自己的實驗室。他顯然已經決定將尋找凋亡通路
中的蛋白定為實驗室未來的研究方向。
順着以前的研究而上，他首先想鑑定直接剪切caspase 3的蛋白酶究竟是什麼。當倉鼠
肝細胞組織勻漿液與caspase 3溫育後，caspase 3被其中的蛋白酶剪切成兩個片斷。追
蹤這個活性，他實驗室純化得到了這個蛋白，測序結果顯示它也是一個ICE蛋白酶的成
員，與人的caspase 2高度同源7。仍然是“體外assay跟蹤純化進程”這一套，王已經
掌握程咬金的“三板斧”了。
王曉東意識到caspase 3的剪切是凋亡的一個簡單的檢測指標，通過它建立體外assay，
跟蹤活性，可能可以找出細胞凋亡的通路。首先他想找到在體外能刺激啟動凋亡的小分
子。他把手頭有的激酶、去磷酸酶抑製劑、核苷酸等，加入到未啟動凋亡的Hela細胞質
裂解液中。非常幸運地，他篩選到ATP或dATP能夠激活細胞裂解液的凋亡反應：1、
caspase 3 被剪切激活，2、下游分子PARP和SREBP能被激活的caspase 3剪切，3，當用
激活的細胞質裂解液與倉鼠肝細胞的細胞核溫育，細胞核的DNA被分解成核小體片斷大
小的DNA，這是細胞凋亡的經典指標。
藉助於caspase 3被剪切和細胞核DNA分解這兩個assay，王對細胞質裂解液進行分級純
化，跟蹤引起凋亡的活性組分。當他們過第一個純化柱後，發現結合在柱子上的蛋白和
通過柱子的蛋白只有重新混和在一起後，才能對dATP有凋亡反應。這表明兩個組分可能
分別代表一個凋亡反應蛋白。通過固定一個組分跟蹤另一個組分的方法，王和他的第一
個學生劉雪松展開了競賽：看誰先純化到其中的一個蛋白。但是老革命被新兵打敗了。
劉雪松發現用50％（90％？）硫酸銨沉澱組分後，活性成分仍然處在上清中，而此時的
上清其它蛋白已經很少了，很快地，劉雪松把組分純化到了一條帶。
傳奇有時候是由巧合加運氣造就的。這條帶在PAGE膠上竟然是紫色的。王對它的光譜進
行分析，發現它的光譜與細胞色素C一樣，而蛋白測序的結果也確證了這個結論。王對
於花這麼大功夫純化到在公司可以輕易買到的蛋白感到萬分沮喪，而細胞色素C是線粒
體電子傳遞鏈中的組分，它本不應該分布在細胞質裂解液中，另外對於線粒體在凋亡中
有什麼作用，王是沒有一點頭緒。
慢着！前面提到的抑制凋亡的bcl-2蛋白就是分布在線粒體外膜上的。當用細胞色素C的
抗體特異地除掉細胞色素c後，細胞質裂解液也不對dATP反應。進一步地，王證明是因
為破碎細胞的時候過於粗暴，線粒體在製備細胞質裂解液中被破壞了，如果加入蔗糖保
護線粒體，裂解液將不再對dATP起凋亡反應（錯誤造就了發現！）。最後，如果用凋亡
分子刺激細胞，王發現細胞色素c的確從線粒體釋放到細胞質中。這些實驗無可辯駁地
證明了線粒體參與了凋亡的反應6。
王曉東純化的那個組分在過另外一個純化柱後又分成了兩個必需組分，順理成章地，這
兩個組分最後被純化並命名為Apaf-1和caspase 98,9。謎底揭開了：Apaf-1正是線蟲
ced-4在人中的同源蛋白，而這些結果進一步說明細胞色素c在凋亡中的作用無可置疑。
王將研究的注意力集中在闡述這三個蛋白的相互關繫上。
Apaf-1通過N端的CARD結構域與caspase 9相互結合，通過C端的WD結構域與細胞色素c相
互結合，通過Walker’s結構域與ATP/dATP相互作用。因為與Apaf-1共沉澱的多為ADP而
非ATP形式，加之不能水解的ATP類似物AMP-PNP或者ATP-γ-s不能導致caspase 3剪切，
王當時推測ATP的水解是必需的。但是同期與其他科學家合作的發現讓王重新審視了這
一設想：通過比較Apaf-1和在果蠅中的同源蛋DARK的序列發現，原先被認為負責ATP/
dATP降解的兩個氨基酸在DARK中並不保守，這提示ATP/dATP的降解在凋亡反應中也許並
不是必須的。進一步的實驗結果驗證後者才是正確的：與純度更高的Apaf-1/caspase 9
/cytochrome c複合體結合的主要形式是dATP而不是dADP；複合體在凋亡前後結合的
dATP並沒有被降解為dADP；ATP的另外一個非降解類似物ADPCP同ATP一樣可以啟動凋亡。
通過重組表達蛋白的體外重建系統，以及後來與其它實驗室合作對複合體結構的研究結
果，王的實驗室清晰地描繪了這些蛋白在凋亡中相互作用的情景：細胞收到凋亡信號刺
激後，細胞色素c從線粒體中釋放到細胞質，它與Apaf-1作用增進了與ATP/dATP的結合
，與ATP/dATP的結合使Apaf-1蛋白CARD結構域相互作用多聚化，形成的含有7軸對稱的
蛋白和核苷酸的複合體被命名為凋亡體。凋亡體中的Apaf-1結構發生改變，招募
caspase 9並導致caspase 9被剪切成兩段，從而被激活。激活了的caspase 9進一步地
剪切caspase 38-12。
王的以上發現在生物界扔了一顆重磅炸彈，很多科學家參與到細胞凋亡的領域中來，競
爭開始變得非常激烈，而凋亡的研究也在飛速發展。
乘勝追擊-凋亡體上游與下游執行蛋白的發現
順流而下，capspase 3的激活導致了細胞核DNA被剪切成核小體DNA大小的片斷，那麼中
間的執行者是什麼蛋白呢？如果將激活的caspase 3加入Hela細胞裂解液並與倉鼠肝細
胞核溫育，細胞核內的DNA被剪切成片斷。這說明裂解液中存在執行蛋白。通過以上的
體外assay，跟蹤裂解液純化的過程，鑑定出兩個異源二聚體蛋白：DFF45和DFF4013。
DFF40是其中的活性蛋白，DFF45是DFF40的伴娘分子（chaperone），如果沒有DFF45共
表達幫助摺疊，單獨表達的DFF40沒有剪切染色質DNA的活性。同時DFF45抑制DFF40的活
性，DFF複合體本身沒有活性，激活的caspase 3把DFF45剪切成片斷後，DFF40才從複合
體中釋放出來行使功能13-16。
在純化DFF的時候王發現了一個奇怪的現象：被激活的DFF與細胞核溫育可以剪切染色質
DNA，但是基本上不剪切裸露的DNA。這促使王考慮到可能在核內存在着另外的因子介導
或者幫助DFF40切割染色質DNA。DFF40本身有剪切裸露DNA的微量活性，但是當加入細胞
核裂解液後這種活性得到了提高。據此建立assay，對細胞核裂解液進行分級純化，鑒
定出這個蛋白是HMG-217。相似地，HMG-1和histone可能通過招募的方式也能提高DFF40
切割裸露DNA的活性15。
DFF敲除的老鼠細胞仍然在調亡刺激後有殘餘的剪切染色質DNA的活性，表明除了DFF以
外有其它因子負責剪切染色質DNA。當時其他科學家已經發現AIF能從線粒體中釋放並能
直接導致細胞核染色質的片斷化。王想系統篩選出另外的從線粒體釋放並直接導致細胞
核染色質DNA片斷化的因子。它將線粒體和細胞核溫育，當加入刺激線粒體釋放
cytochrome c（認為此時其它因子也一起從線粒體釋放）的因子後，細胞核染色質DNA
發生片斷化。據此建立assay，將處理後的線粒體上清蛋白進行分級純化，鑑定出了
endonuclease G蛋白。endonuclease G是線粒體特異的核酸酶，它單獨就能夠剪切細胞
核染色質DNA和降解裸露的DNA。Edonuclease G 的發現進一步說明了線粒體能存在一種
途徑不依賴於caspase而導致調亡事件的發生18。
逆流而上，王想知道什麼因子影響了線粒體cytochrome c的釋放。早在發現cytochrome
c在凋亡的作用後，本能的反應也應該是另外一個分布在線粒體外膜的凋亡蛋白bcl2與
cytochrome c有沒有什麼關係。王找到兩個細胞株：bcl2低表達的HL-60 neo和bcl2高
表達的Bcl-2。用調亡刺激物刺激後，前者啟動了調亡，cytochrome c釋放，而後者則
啟動調亡，也沒有cytochrome c的釋放。這個結果表明bcl2可能通過抑制cytochrome c
從線粒體的釋放來抑制調亡的19。
進一步地，王建立了以下assay鑑定刺激細胞色素c釋放的因子：加活性形式的caspase
8到細胞質裂解液，與線粒體溫育，cytochrome c釋放。據此，對裂解液進行分級純化
，鑑定出蛋白tbid。Caspase 8剪切tbid，tbid的C端片斷從細胞質中轉位到線粒體，引
起細胞色素c的釋放。Bcl2可以與tBid結合併拮抗它誘導細胞色素c釋放的功能20。
對實驗現象的敏銳觀察往往能有新的發現。王在實驗中發現，在體內，2小時UV照射後
的細胞分離出來的線粒體才能觀察到細胞色素c的釋放和Bak的寡聚化（Bak寡聚化後被
認為在線粒體膜上形成了孔道供蛋白通過，Bak的寡聚化是調亡的另一個指標）。在體
外，30分鐘UV照射後的細胞分離出來的線粒體，在37度溫育30分鐘後即可以看到等量
Bak寡聚化以及細胞色素c的釋放。體內的細胞色素c的釋放相比於體外至少被延遲了一
個小時。這進一步肯定了體內存在抑制細胞色素c釋放的因子。將UV照射1小時後分離的
線粒體與未照射的細胞質裂解液混和，發現後者具有抑制細胞色素c釋放的活力。跟蹤
這個活力對裂解液進行半純化，用已知的Bcl-2家族蛋白的抗體發現活性成分包括Mcl-1
和Bcl-XL。進一步的實驗發現，UV照射導致Mcl-1蛋白合成的停頓以及Bcl-XL從細胞質
中轉位到線粒體。前者是後者的上游事件21。
Smac的發現是另外又一個小現象大發現的例子。在研究apoptosome過程中，王發現如果
在製備細胞裂解液的溶液中加入去垢劑，caspase 3的被剪切活性會增加，而製備了裂
解液後再加入等量去垢劑則不具有這種效應。很顯然的一個推斷是去垢劑增加了膜蛋白
的溶解，即某種膜蛋白能提高這種活性。果然，細胞膜沉澱後用去垢劑重新溶解的樣品
具有提高這種活性的能力。依此建立assay，對細胞膜樣品分級純化，得到了Smac蛋白
。通過生化實驗以及與華人施一功實驗室解晶體結構的合作研究，王得到了一系列重要
發現。在調亡過程中，Smac從線粒體中釋放出來，通過與IAP（caspase的一類抑制蛋白
）相互作用，釋放出與IAP結合的caspase，從而解除了IAP對caspase的抑制。在研究中
，王偶然發現GST融合表達的Smac完全沒有活性，這提示Smac的N端是極其重要的。Smac
N端的四個氨基酸與它在果蠅中的同源蛋白非常保守。進一步分析發現，體外合成的這
四個氨基酸就有拮抗IAP的功能。Smac發現之後，其它實驗室發現了另外一個拮抗IAP的
蛋白Omi/protein22-24。
值得一提的是，同時期的科學家的發現完善了調亡的線粒體途徑。由於該領域激烈競爭
，王對Smac以及之前的endonuclease G研究的結果都是和其它科學家的結果同時發表在
一個期刊上。而更多的蛋白純化鑑定出來之後發現別人已經對它有研究了。不過王的結
果都是用體外重建的方式清晰闡明的，這些結果進一步梳理了調亡的線粒體途徑（圖二
）。
超越－新的視角，新的起點
以上的重要發現讓王曉東獲得了榮譽，也使他有能力重新審視這一切，決定新一輪的研
究方向。
早在2000年，王曉東就曾雄心勃勃地想通過體人工脂質體體外重建細胞色素c從線粒體
中釋放的過程。這表明他的雄心早已超越他的成就。儘管這一計劃沒有實現，但他因此
而發現了磷脂Cardiolipin能幫助活化的tBid定位到線粒體25。
王曉東回溯過去最開始對cytochrome c的研究，難道當初篩選到dATP就是運氣嗎？篩選
幾個區區的分子竟然就篩到了，那麼體內應該有和dATP類似功能的能啟動細胞質裂解液
調亡程序的小分子吧？這種小分子還有可能用於開發藥物。通過檢測caspase 3的活性
，王篩選了2萬中細胞成分，結果發現小分子PETCM能夠象dATP激活caspase 3。跟蹤活
性分級純化，活性成分分成三組Q-ft（包含cytochrome c），Q30（包含Apaf-1和
caspase 9）,Q100。這三個組分重新組合後加入PETCM並不能激活caspase 3，而需要微
量的dATP。這表示在總裂解液中內源的微量dATP支持PETCM激活caspase 3的活性。對
Q100進行純化後發現活性組分是三個相互間高度同源相互結合的PHAP蛋白。但是純化後
發現單獨的PHAP與Q-ft和Q100就能激活caspase 3，並不需要PETCM。但是如果再加入
Q100，PHAP就失去這種能力，需要PETCM加入才能激活caspase 3。這表明Q100中有PHAP
的抑制蛋白。對這種抑制活性進行跟蹤純化，發現它是Pro T蛋白。進一步的體內體外
實驗表明：PHAP促進caspase 9的激活，ProT抑制調亡體的形成，而PETCM則解除ProT的
抑制效應。這些發現也幫助解釋了以前一直困擾的問題：為什麼當初dATP需要加超過生
理濃度很多時才能激活調亡反應26。
細胞調亡基礎研究的快速發展也為應用做好了準備。例如Smac的N端氨基酸促進調亡的
作用有可能用於開發治療癌症。王與其他人合作，積極進行這方面的研究27。
此外王曉東還將“建立體外檢測體系－跟蹤純化活性”的模式用於研究RNAi的機理，從
果蠅中純化到了R2D2，它與Dicer 2形成的複合體能夠與siRNA結合併加強指向的mRNA的
降解28。
結語
由於王曉東的研究邏輯清晰，方法簡單明了，在按時間順序閱讀文獻的過程中，通過預
測文獻的內容以及當年王曉東即將開展的工作，我得到了象看推理小說一樣的樂趣。而
預測之外的許多工作都讓我茅塞頓開，受益匪淺。正是這些樂趣與受益支撐我花很多時
間和努力看完文獻並寫下此文。
這種受益是全面的：不同assay的微小差別決定了純化得到的蛋白的不同；體外重建的
清晰性給我留下了很深的印象；我發現有幾篇文章的內容和質量都遠遠超出所發表雜誌
的要求，而國內實驗室肯定會犧牲競爭需要的時間往高分雜誌投，或者將文章拆成幾篇
；文章文字的簡潔；通過突變分辨是自剪切還是其它蛋白的剪切；體外實驗應該取得體
內實驗的支持；為了確證最好用不同的細胞株不同的調亡刺激重複實驗；對於王曉東為
何在高度競爭的領域能一直處於領先，我有了自己的一些猜測；對於調亡的研究，我有
了自己的一些想法……
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