本文是
誰設計、製造了新冠病毒（三 上）

續文的一部分，為避免續文篇幅過長，現將這部分內容摘出來另成一文。

冠狀病毒刺突蛋白RBD中有五個重要位點，這五個位點上的氨基酸殘基決定刺突蛋白的ACE2結合能力，進而決定冠狀病毒通過結合ACE2受體進入、感染細胞的能力，它們被稱為（ACE2相關的）RBD關鍵氨基酸殘基，簡稱RBD關鍵氨基酸或RBD關鍵殘基。RBD即受體結合域（Receptor Binding Domain），它是冠狀病毒刺突蛋白（spike protein，簡稱S蛋白）S1亞基的一部分。

“誰設計、製造了新冠病毒（三 上）”指出：新冠病毒的RBD關鍵氨基酸借鑑自蝙蝠冠狀病毒rs3367（WIV1），新冠、rs3367（WIV1）的5個RBD關鍵氨基酸三個相同，另有一對理化屬性高度相似。

下面是Ralph S. Baric（團隊）研究RBD關鍵氨基酸的四個論文實例，前兩篇論文的介紹較長，讀者可根據個人興趣擇要閱讀、跳躍閱讀。

論文B-1

2007年12月19日，Ralph S. Baric領導的團隊在Journal of Virology（病毒學雜誌）在線發表了如下論文：Mechanisms of Zoonotic Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Host Range Expansion in Human Airway Epithelium（人畜共患SARS冠狀病毒在人氣道上皮中擴大宿主範圍的機制）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2258931/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.02041-07

這篇論文需要介紹的內容頗多，展開之前，先概括一下論文的兩大要點：
1、果子狸冠狀病毒SZ16不能感染人類和靈長類動物；人為替換SZ16的第三關鍵氨基酸，將所得中間病毒放到人氣道上皮中培養，促其進一步發生適應性突變，得到了兩種可跨物種感染、傳播的冠狀病毒，這兩種病毒都能感染人氣道上皮細胞和靈長類動的Vero E6細胞。

2、深入研究了冠狀病毒RBD與hACE2的作用機制，分析、解讀了RBD關鍵氨基酸替換、變異，如何影響、改變ACE2結合能力的內在機理。

下面看論文具體細節。

論文病毒改造的原材料之一是果子狸（civet，有時譯作麝香貓）類SARS冠狀病毒SZ16（SARS-CoV SZ16），它分離於SARS疫情期間，分離自中國廣東地區動物市場中的果子狸。

SARS病毒既能感染人類，也能感染果子狸，但SZ16隻能感染果子狸，不能感染人類。為解讀二者感染能力不同的內在機制，論文列出了SZ16、兩種SARS流行病毒株SARS Urbani、SARS GD03三者刺突蛋白的所有氨基酸差異，見下圖：

Urbani、GD03、SZ16的刺突蛋白氨基酸差異

圖中藍色標示動物來源的氨基酸（與SZ16中氨基酸一致的氨基酸），黃色標示SARS疫情早期出現的氨基酸，橙棕色標示疫情中期出現的氨基酸，紅棕色標示疫情晚期出現的氨基酸。

SZ16與SARS Urbani有18個刺突蛋白氨基酸差異，其中16個不同氨基酸位於S1亞基，5個位於RBD，二者有兩個不同RBD關鍵氨基酸（見上圖中加粗加黑的第479、487氨基酸）。
刺突蛋白包括S1亞基、S2亞基兩部分，S1亞基是受體結合亞基，S2亞基是膜融合亞基，RBD即受體結合域是S1亞基的一部分。

SARS Urbani是分離於SARS疫情晚期，分離自美國的一個SARS病毒株；

SARS GD03是更晚出現的SARS病毒株，它分離於2004年1月疫情再次零星出現時，分離自一位散發廣東患者。

2002~2003年的SARS疫情發生於2002年11月16日－2003年9月2日，高峰期為2002年11月16日－2003年7月16日。

如前所述，SZ16與SARS Urbani有兩個RBD關鍵氨基酸不同。論文將證明，以SZ16的刺突蛋白為原材料，通過改變其RBD關鍵氨基酸，可以改造、培育出有人體細胞感染能力的新病毒。具體的實施過程如下。

1、用SZ16的刺突蛋白和SARS Urbani的骨架（刺突蛋白外部分）合成了嵌合病毒icSZ16-S。
合成嵌合病毒icSZ16-S的更多細節是這樣的：用SZ16刺突蛋白部分的基因序列，和SARS Urbani骨架部分的基因序列，拼出一個嵌合基因序列，而後基於嵌合基因序列，使用反向遺傳平台合成嵌合病毒的cDNA、RNA，將所得RNA電穿孔釋放到培養細胞中，利用RNA的複製能力，最終在培養細胞中收穫嵌合病毒的活性毒株。
基於基因序列合成病毒cDNA、RNA，收穫病毒毒株，這是反向遺傳平台的基本功能。
嵌合病毒icSZ16-S的刺突蛋白來自SZ16，骨架來自SARS Urbani。實驗證明，和SZ16一樣，icSZ16-S既不能感染Vero E6細胞（非洲綠猴腎細胞系細胞），也不能感染HAE細胞（人氣道上皮細胞）。

註：
ic：infectious cDNA，ic前綴代表病毒是反向遺傳平台合成的有生物活性的實驗室冠狀病毒。SZ16-S表示嵌合病毒icSZ16-S的S蛋白來自SZ16，S蛋白即Spike蛋白，也就是刺突蛋白。
HAE細胞：human airway epithelium cells，人氣道上皮細胞，包括纖毛上皮細胞、非纖毛上皮細胞以及杯狀細胞。

2、接下來要做RBD關鍵氨基酸的替換了。研究者將icSZ16-S刺突蛋白的第479氨基酸--賴氨酸K替換為天冬酰胺N（亦稱為天門冬酰胺），人為製造了一個氨基酸突變K479N。賴氨酸K是SZ16的第479氨基酸，天冬酰胺N是SARS的第479氨基酸，第479氨基酸是SARS及SZ16五個RBD關鍵氨基酸中的第三個。因此，K479N就是將icSZ16-S的第三關鍵氨基酸替換為SARS的第三關鍵氨基酸。

SZ16的第479氨基酸是賴氨酸K，SARS Urbani、GD03的第479氨基酸是天冬酰胺N。

3、對icSZ16-S施以K479N替換得到了另一個改造病毒：icSZ16-S K479N（要使用反向遺傳平台，基於替換後的基因序列將其合成）。簡明地說，把icSZ16-S 的479氨基酸由賴氨酸K替換為天冬酰胺N，就得到了icSZ16-S K479N。實驗證明，相比icSZ16-S，icSZ16-S K479N對Vero E6細胞和HAE細胞的感染能力有所“進步”，它能感染Vero E6細胞和HAE細胞（人氣道上皮細胞），不過只能在兩種細胞中低水平地複製，衰弱地傳代。

4、為提升icSZ16-S K479N對HAE細胞的適應能力，研究者將其接種到人氣道上皮組織中，按一定的策略、方式進行培養，並在其反覆傳代的過程中加以篩選優化。

培養、傳代、篩選的第8天，得到了一個新病毒icSZ16-S K479N D8。相比icSZ16-S K479N，D8發生了一個適應性變異Y442F，即，其刺突蛋白第442氨基酸由酪氨酸Y變異為苯丙氨酸F；

培養、傳代、篩選的第22天，又得到了一個新病毒icSZ16-S K479N D22。D22在Y442F變異的基礎上，又發生了另一處適應性變異L472F，即，其刺突蛋白第472氨基酸由亮氨酸L變異為苯丙氨酸F。

刺突蛋白的第442氨基酸是SARS和SZ16的第一個RBD關鍵氨基酸，第472氨基酸是它們的第二個RBD關鍵氨基酸。也就是說，人為替換icSZ16-S的第三RBD關鍵氨基酸後得到的中間病毒icSZ16-S K479N，在實驗室環境下的人氣道上皮組織中，又發生了另外兩個RBD關鍵氨基酸，第一、第二RBD關鍵氨基酸的適應性突變。

相關病毒RBD關鍵氨基酸對照表，表中展示了K479N替換、Y442F變異、L472F變異所涉及的RBD關鍵氨基酸

有一個小小的巧合，新冠病毒、WIV1病毒、icSZ16-S K479N D22病毒的第二個RBD關鍵氨基酸都是苯丙氨酸F。

新冠、WIV1、SARS、D22四病毒RBD關鍵氨基酸對照表

論文以四組體外細胞實驗證明：
1、icSZ16-S K479N D22和icSZ16-S K479N D8都能有效感染HAE細胞、Vero E6細胞、DBT-hACE2細胞，並在細胞中有效複製。
2、D8在三種細胞中的複製能力或多或少弱於D22，D22在三種細胞中的複製能力又或多或少弱於icSARS（使用反向遺傳平台合成的SARS流行毒株Urbani的克隆毒株）。
3、icSZ16-S K479N在HAE細胞和DBT-hACE2中的複製能力低下，複製滴度與D22、D8相差好幾個數量級（即D22、D8在兩種細胞中的複製能力大大強於K479N）。
4、icSARS、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D8、icSZ16-S K479N D22都不能感染未轉基因的普通DBT細胞。

icSARS、K479N、D8、D22對HAE、Vero E6、DBT-hACE2、普通DBT細胞的感染實驗數據圖。
橫坐標：感染後時間，單位為小時；縱坐標：細胞培養物中的病毒滴度，單位為PFU/ml。

註：
PFU，Plaque-forming unit，單位體積的病毒形成的空斑數，是代表有活性的病毒粒子濃度的單位。空斑(Plaque)是病毒誘導宿主細胞裂解形成的點狀物，可通過顯微鏡觀察。
DBT-hACE2是Ralph S. Baric團隊設計、製造的一種表達hACE2的轉基因小鼠DBT細胞，其細胞的跨膜糖蛋白--ACE2受體被轉基因為hACE2。
DBT：Delayed Brain Tumor，延遲腦腫瘤；小鼠DBT細胞，即小鼠延遲腦腫瘤細胞，或稱為小鼠星形細胞瘤遲發性腦瘤細胞。

論文還以小鼠體內實驗證明：D8和D22還能感染BALB/c小鼠（白變種實驗室小鼠）的肺細胞，並在小鼠肺中良好生長、複製，不過，它們都不會使BALB/c小鼠產生臨床疾病症狀。

可見：
1、D8和D22是具有跨物種感染能力的病毒，它們能有效感染人氣道上皮細胞，靈長類動物的Vero E6細胞，小鼠的肺細胞。
2、通過替換、改造、改變RBD關鍵氨基酸，可以改變刺突蛋白的ACE2結合能力，改變冠狀病毒的細胞感染能力，擴大其宿主範圍，可以將不能感染人類，不能跨物種感染的冠狀病毒改造為可感染人類，能夠跨物種感染的冠狀病毒。早在2007年，Ralph S. Baric就已成功嘗試了相關技術。

論文使用蛋白質結構設計、預測工具Rosetta Design生成了SZ16、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D8和icSZ16-S K479N D22等病毒的RBD結構模型，並將這些結構模型疊加到SARS Urbani RBD與hACE2相互作用的晶體結構模型上，得到了上述四種病毒與hACE2相互作用的晶體結構模型。

論文藉助晶體結構模型研究了病毒RBD與hACE2的作用、結合機制，通過對照這些病毒刺突蛋白第442、472、479、487四個位點的氨基酸差異及與hACE2的作用差異，解讀了氨基酸差異影響hACE2結合能力的機理，解釋了這些病毒的不同細胞感染能力。上述四個氨基酸是相關各病毒的第一、第二、第三、第四RBD關鍵氨基酸；論文未對照這些病毒的第五RBD關鍵氨基酸，即刺突蛋白的第491氨基酸，因為該位點的氨基酸極為保守，論文中各病毒的第五RBD關鍵氨基酸全都相同，都是酪氨酸Y。具體解讀細節見下（供有興趣者參考，普通讀者可跳過）：
a）SZ16與hACE2作用的晶體模型圖B顯示，SZ16的第479氨基酸殘基—Lys479（賴氨酸K），似乎與鄰近的兩個hACE2氨基酸殘基Lys31、His34（His代表組氨酸）存在碰撞（靜電排斥），導致SZ16的刺突蛋白不能與hACE2良好結合。圖B中Lys31和His34周圍的點密集團塊為深褐色，模型中的深褐色團塊表示相應的hACE2殘基與附近的RBD殘基存在衝突（靜電排斥或碰撞）。

b）icSZ16-S K479N與hACE2作用的晶體模型圖C顯示，引入點突變K479N後，即將Lys479 （賴氨酸K）替換為Asn479（天冬酰胺N）後，479位點與hACE2殘基的排斥力被消除，使得icSZ16-S K479N的刺突蛋白能夠與hACE2結合。圖C中Lys31和His34兩個hACE2殘基周圍的團塊為淺綠色，模型中的淺綠色團塊表示相應的hACE2殘基與周圍的RBD殘基相互吻合。

c）前面的晶體模型圖A顯示，SARS Urbani 的兩個RBD關鍵氨基酸殘基Tyr442、Asn479各自與不同的hACE2殘基發生作用（Tyr442與Lys31相互作用，Asn479與His34相互作用），二對作用互不干擾，互不競爭，因而Urbani刺突蛋白與hACE2的結合親和力較強；儘管icSZ16 K479N 的442、479殘基與Urbani相同，但軟件預測（見上面的晶體模型圖C），它的Tyr442、Asn479會同時與hACE2殘基Asp32發生作用，同時，Tyr442殘基還和兩個hACE2殘基Asp32、Lys31同時發生作用。這種RBD殘基與ACE2殘基作用時的交叉競爭削弱了RBD與hACE2的結合親和力，因而，icSZ16 K479N的刺突蛋白雖然能與hACE2結合，但結合能力較弱。

d）icSZ16-S K479N（以下簡稱K479N）、SARS Urbani二者唯一不同的RBD關鍵氨基酸是第487氨基酸（SZ16與Urbani有兩個不同RBD關鍵氨基酸479、487），即第四個RBD關鍵氨基酸（參見前面的“相關病毒關鍵氨基酸對照表”）。K479N 的第487氨基酸是Ser487（絲胺酸-S），它只與一個hACE2殘基Tyr41結合，見晶體模型圖C；SARS Urbani 第487氨基酸是Thr487（蘇胺酸-T），它獨自結合了三個hACE殘基，而且沒有其它RBD殘基交叉競爭與這三個hACE殘基的結合，見前面的晶體模型圖A（但我在圖A中未看到與Thr487作用的三個hACE2殘基？？？）。因而Urbani的Thr487 殘基與hACE2間的氫鍵強於K479N 的Ser487 殘基與hACE2間的氫鍵，這是Urbani的刺突蛋白與hACE2的結合親和力強於K479N的刺突蛋白與hACE2的結合親和力的另一個原因。

e）如晶體模型圖D所示，Rosetta Design預測icSZ16-S K479N D8的Y442F突變消除了icSZ16-S K479N的442、479殘基對hACE2殘基的交叉競爭，D8的Phe442（苯丙氨酸F442）、Asn479各自與不同的hACE2殘基作用（Phe442結合Lys31，Asn479結合His34）；與此同時，它的Ser487殘基與hACE2的Tyr41殘基間的相互作用和氫鍵網絡保持不變。因此，D8的hACE2結合能力大大提升，它在HAE細胞和DBT-hACE2細胞中的生長（感染、複製）比K479N茁壯得多。

f）仍如晶體模型圖D所示，Rosetta Design還預測icSZ16-S K479N D8的Leu472（亮氨酸L472）殘基無交叉競爭地同時結合了兩個hACE2殘基Leu79、Met82（Met代表甲硫胺酸M）；icSZ16-S K479N D22是D8發生L472F突變（亮氨酸L突變為苯丙氨酸F）得到的，如下面的晶體模型圖E所示，Rosetta Design預測其Phe472（苯丙氨酸F472）殘基將無交叉競爭地同時結合三個hACE2殘基Leu79、Met82、Tyr83。Rosetta Design還預測Phe472與這三個hACE2殘基間存在強烈的疏水相互作用，進一步加強了彼此的結合。因此，L472F突變增強了D22 RBD與hACE2的結合親和力，提升了D22對HAE細胞、DBT-hACE2細胞的感染、複製能力（相比D8）。

可見，早在2007年，Ralph S. Baric就掌握了通過RBD關鍵氨基酸替換、變異，改變ACE2結合能力、細胞感染能力，擴大宿主範圍的技術，並深入研究了這一技術的內在機制。

在論文Disscussion部分，研究者意猶未盡地寫道：
顯然，可能存在多種遺傳途徑來允許人畜共患病SARS冠狀病毒宿主範圍的擴大，確定其他接觸界面點突變是否能增強人畜共患病病毒對HAE細胞（人氣道上皮細胞）的感染將是一件有趣的事情。

所謂的“接觸界面點”，是指RBD中與ACE2發生直接接觸、作用的14個氨基酸殘基，RBD關鍵氨基酸就是這14個RBD接觸殘基中對ACE2結合能力起決定作用的五個氨基酸殘基。論文人為製造了第三RBD關鍵氨基酸的K479N突變，上面一段話的言下之意，是可以嘗試以製造其它RBD關鍵氨基酸的人為突變作為病毒改造、培育的起點。

論文B-2

2008年9月1日（Published online 2008 Jun 25），Ralph S. Baric領導的團隊在Journal of Virology發表了如下論文：Pathways of Cross-Species Transmission of Synthetically Reconstructed Zoonotic Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus（人畜共患嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒的跨物種傳播途徑）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2519660/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.00818-08

論文B-2是論文B-1研究的後續。

論文研究了7種病毒對3種細胞的感染、複製能力，探討、解讀了病毒的細胞感染、複製能力差異與RBD關鍵氨基酸-ACE2作用差異之間的內在關聯。7種病毒是：
病毒1：論文B-1中的嵌合病毒icSZ16-S，它的刺突蛋白來自果子狸冠狀病毒SZ16，骨架來自SARS Urbani；
病毒2：icSZ16-S K479N，它是將icSZ16-S的479氨基酸（賴氨酸K）替換為SARS 的第479氨基酸（天冬酰胺N）得到的病毒；
病毒3：icSZ16-S K479N D22，它是在人氣道上皮組織中培養、傳代、篩選22天后得到的icSZ16-S K479N的實驗室變異體；
病毒4-6：三個SARS病毒株的克隆：icSARS、icCUHK-W1、icGZ02，
icSARS是SARS Urbani的克隆，SARS Urbani是SARS疫情晚期分離自美國的SARS病毒株，
GZ02是SARS疫情早期分離自廣州的SARS病毒株，
CUHK-W1是SARS疫情中期分離自香港的SARS病毒株。
病毒7：icGD03-S，它應該是由SARS GD03的刺突蛋白與SARS Urbani的骨架嵌合成的SARS不同毒株的混嵌體。

GD03是更晚出現的SARS病毒株，它是2004年1月疫情再次零星出現時從一位散發廣東患者體內分離得到的。
（2002~2003年的SARS疫情發生於2002年11月16日－2003年9月2日，高峰期為2002年11月16日－2003年7月16日）

論文詳細考察了7種病毒刺突蛋白（spike）的氨基酸差異，以及刺突蛋白、ACE2的相互作用殘基。

圖D：相關病毒的spike蛋白氨基酸差異；圖E：ACE2、SARS-Urbani的所有接觸殘基

圖D列出了7種病毒間的所有氨基酸差異，並標出了其它6種病毒相對於SARS Urbani的不同刺突蛋白氨基酸個數。如icSZ16-S K479N D22（即圖中的SZ16-S K479N D22）有19刺突蛋白氨基酸與SARS Urbani不同（不相同的氨基酸殘基背景為灰色）。

圖E列出了與SARS Urbani的spike發生接觸或作用的所有cACE2（civet ACE2）、hACE2/primate-ACE2（靈長類動物ACE2）氨基酸殘基，及與各個ACE2殘基發生作用的SARS Urbani的接觸殘基（氨基酸殘基）。

論文B-1研究、實驗了相關病毒對HAE細胞（人氣道上皮細胞）、Vero E6細胞、普通小鼠DBT細胞、轉基因小鼠DBT-hACE2細胞的感染、複製能力。當前論文（B-2）引入了另一種轉基因小鼠DBT細胞：DBT-cACE2，它的mACE2（mice ACE2）轉基因為cACE2（civet ACE2，果子狸或麝香貓的ACE2）。

論文設計、實施了三組體外感染實驗，7種病毒對3種細胞DBT-cACE2 、DBT-hACE2、Vero E6的感染、複製實驗數據見下圖：

7種病毒對3種細胞的感染複製實驗數據圖

橫坐標是感染後時段，單位為小時；縱坐標是病毒的複製滴度，單位為PFU/ml。

實驗結果表明：
1、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22和icCUHK-W1要麼不能在DBT-cACE2細胞中有效複製，要麼只能低水平複製（滴度小於10^3）；而其它4種病毒，包括icSZ16-S在內都能在DBT-cACE2細胞中有效複製（滴度大於10^4），見實驗數據圖中的坐標圖A；

2、icSZ16-S不能在DBT-hACE2細胞中有效複製（滴度約為10^2），而其它6種病毒都能在DBT-hACE2細胞中不同程度地複製（K479N複製能力相對最差，滴度略低於10^4），見坐標圖B；

3、icSZ16-S不能在Vero E6細胞中有效複製（滴度僅略高於10^2），而其它6種病毒都能在Vero E6細胞中不同程度地複製（滴度大於10^5），GZ02、CUHK-W1、icSARS、icSZ16-S K479N D22這四種病毒在Vero E6細胞中的複製都極為強烈（滴度大於10^7），見坐標圖C；

4、icSZ16-S K479N D22對Vero E6、DBT-hACE2的感染、複製能力強於icSZ16-S K479N ；K479N 替換使icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22獲得了對Vero E6、DBT-hACE2的感染、複製能力，但同時使它們喪失了icSZ16-S所具有的對DBT-cACE2細胞的感染、複製能力。

論文還指出：上述7種病毒都不能感染未轉基因的普通小鼠DBT細胞。

icSZ16-S、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22三者不同物種ACE2結合能力，不同物種細胞感染、複製能力的顯著差異是它們RBD關鍵氨基酸的差異造成的。

相關病毒RBD關鍵氨基酸對照表

為進一步研究RBD與cACE2、hACE2作用的內在機制，解讀RBD關鍵氨基酸差異對物種ACE2結合能力影響的內在機理，論文使用RosettaDesign和Modeler兩種軟件構建了4種病毒（SARS Urbani、SZ16、icSZ16-K479N、SZ16-K479N D22）的刺突蛋白與cACE2、hACE2的作用模型（二維、三維結構模型）。以下為論文所作解讀（供有興趣者參考，普通讀者可略過）：
1、cACE2、hACE2有兩個不同的RBD接觸殘基（與RBD接觸的ACE2氨基酸殘基）（cACE2的E30、Y34在hACE2中為D30、H34），模型預測，E30和Y34的附加甲基可能會使cACE2結合界面產生明顯的突起（我在模型圖B下部的三維圖中目測看不出cACE2的明顯突起）。模型圖A顯示，Urbani的RBD能良好適應hACE2的結合界面（三維模型圖用淺黃綠色表示與RBD良好吻合的ACE2殘基）；模型圖B顯示，Urbani也能容納cACE2的表面突起（三維模型圖用淺棕色表示與RBD存在衝突，但仍能結合的ACE2殘基）。因此，SARS Urbani對人類和civet（果子狸或麝香貓）有雙重宿主適應能力。

SARS Urbani與hACE2、cACE2，SZ16與cACE2作用模型

2、如模型圖C所示，SZ16 的RBD也能容納E30、Y34形成的表面突起，因而SZ16 的RBD也可與cACE2結合。

3、如模型圖D所示，icSZ16 K479N中的K479N突變（人為替換）引入的479N（天冬酰胺）重塑了SZ16刺突蛋白的結合界面，促進了刺突蛋白與hACE2的結合（論文為什麼不提供、對照SZ16 RBD與hACE2的作用模型？）。

icSZ16 K479N與hACE2、cACE2，icSZ16 K479N D22與hACE2的作用模型

4、如模型圖E所示，SZ16 K479N  RBD的結合界面因K479N替換而被重塑，它的氨基酸殘基（V404、Y440）與cACE2的氨基酸殘基（E30、Y34）產生了衝突，無法容納cACE2的延長突出部分（三維圖中的深褐色部分代表RBD殘基與ACE2殘基間存在難以克服的衝突，難以產生結合的區域）。從而，K479N突變（人為替換）使SZ16 K479N 的RBD獲得了結合hACE2的能力，但同時失去了結合cACE2的能力。

5、如模型圖F所示，Y442F突變和L472F突變在K479N突變基礎上進一步重塑了SZ16 K479N D22的RBD結合界面，大大提高了RBD與hACE2的吻合度和結合效率；

6、如模型圖G所示，和SZ16 K479N一樣，SZ16 K479N D22的RBD也不能容納cACE2的延長突出部分，二者無法結合。

icSZ16 K479N D22與cACE2的作用模型

由論文B-1、B-2可知：
1、早在2007年，Ralph S. Baric就通過人為替換RBD關鍵氨基酸，結合實驗室環境下人體組織適應性培養，改造、培育出了能感染人體細胞，並具有跨物種感染、傳播能力的冠狀病毒。
2、Ralph S. Baric對冠狀病毒RBD（特別是RBD關鍵氨基酸）與不同物種ACE2的作用機制，早在2007、2008年就已經研究得極為深入了。

論文B-3

2015年11月9日，Ralph S. Baric領導的團隊在《自然醫學》（Nature Medicine）雜誌發表了著名的嵌合病毒論文：A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence（一個類似SARS的蝙蝠冠狀病毒群顯示了產生人類流行疫情的潛力）
https://www.nature.com/articles/nm.3985

論文同時研究了WIV1病毒和RBD關鍵氨基酸，它也將作為Ralph S. Baric研究rs3367（WIV1）的示例（論文A-1）被介紹。下面從RBD關鍵氨基酸的角度簡單介紹一下該論文。

WIV1在論文中是病毒主角SHC014的對照病毒。論文比較了WIV1、SHC014與SARS的RBD關鍵氨基酸差異。論文（援引其它論文的實驗結果）指出：WIV1雖然有三個RBD關鍵氨基酸與SARS不同（見下圖，二者第1、第2、第4 RBD關鍵氨基酸不同），但WIV1仍象SARS那樣，其刺突蛋白也能有效結合hACE2；論文接着指出，儘管SHC014的RBD關鍵氨基酸與SARS差異更大，二者的RBD關鍵氨基酸無一相同，但不能就此斷言SHC014的刺突蛋白不能結合hACE2。

SARS、WIV1、SHC014 RBD關鍵氨基酸對照表

為確定SHC014的hACE2結合能力、人體細胞感染能力，論文使用反向遺傳平台，基於SHC014刺突蛋白（的基因序列）與SARS-CoV-MA15骨架（的基因序列）合成了嵌合病毒SHC014-MA15。實驗證明，SHC014-MA15能有效感染人氣道上皮組織，並在組織細胞內大量複製。這表明，SHC014的刺突蛋白也能有效結合hACE2，和WIV1一樣，SHC014也是具有人體細胞進入（感染）能力的特殊蝙蝠冠狀病毒。

論文B-4

2016年3月14日，Ralph S. Baric領導的團隊在PNAS（美國國家科學院院刊）發表了如下論文：SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence（類SARS冠狀病毒WIV1-CoV對人類有潛在威脅）
https://www.pnas.org/content/113/11/3048

論文B-4也同時研究了WIV1病毒和RBD關鍵氨基酸，它還將作為Ralph S. Baric研究rs3367（WIV1）的示例（論文A-2）被介紹。

論文比較了SARS-WT、SARS-MA15、WIV1三病毒與hACE2直接作用（接觸）的14個RBD氨基酸殘基，包括五個RBD關鍵氨基酸殘基，見下圖A；論文構建、研究了SARS、WIV1的刺突蛋白與hACE2的作用模型，對照了二者第一、第二、第四RBD關鍵氨基酸殘基（對應SARS刺突蛋白的第442、472、487氨基酸）與hACE2的作用細節，見下圖B。

圖A：WIV1、SARS 14個ACE2直接作用殘基對照表；圖B：WIV1、SARS 與ACE2的作用模型對照圖

最後是對圖A、圖B的一些補充說明：
1、圖A中的氨基酸序號基於SARS，WIV1中的對應氨基酸序號應+1。
2、SARS-WT，即SARS-CoV wild type，指SARS病毒的野生流行毒株（它應該具體對應SARS Urbani）。
3、SARS-MA15，即SARS-CoV MA15，Ralph S. Baric等人實驗室培育的SARS-CoV小鼠適應性變異體。SARS-CoV能感染小鼠細胞，但不會使小鼠產生臨床疾病症狀，SARS-CoV MA15則可使小鼠嚴重致病並（100%）致死。
4、圖A中，SARS-MA15與SARS-WT不同的氨基酸用深紅背景色標示，WIV1-CoV與SARS-WT不同的氨基酸用深藍背景色標示，紫紅色長條框標出了三病毒的5個RBD關鍵氨基酸殘基。
5、圖B左圖是SARS刺突蛋白S1亞基（也叫受體結合亞基，S1亞基前端為RBD）與hACE2的作用模型，圖B右圖是WIV1刺突蛋白S1亞基與hACE2的作用模型。
左右兩圖右側的雙螺旋結構是hACE2，其上的橙黃色部分是hACE2的RBD接觸殘基；
左右兩圖左側是兩病毒刺突蛋白的S1亞基，SARS的S1亞基以灰黑色表示，WIV1的S1亞基以藍色表示。兩個紅色含環圖案對應兩病毒相同的RBD關鍵氨基酸殘基（479、491），紫色圓圈標出了二者不同的三個RBD關鍵氨基酸殘基（442、472、487）與hACE2殘基的作用情況。